基因工程學案2

1、第二課時基因工程操作的基本步驟、目的基因的獲取1.基因的結(jié)構(gòu)（1）原核生卑基因結(jié)構(gòu) 一非編碼區(qū)I 編碼區(qū) rm編碼區(qū)編碼區(qū)卡邏ATGTGCACGTAGTTA編碼蛋白質(zhì)調(diào)控遺傳信息的表達（調(diào)控程序）編碼區(qū)下舞終（不能編碼蛋白質(zhì)）（能編碼蛋白質(zhì)）-非編碼區(qū)真核生物基因結(jié)構(gòu)（2）真核與原核生物基因結(jié)構(gòu)的比較相同點：都是由能夠編碼蛋白質(zhì)的編碼區(qū)和具有 調(diào)控作用的非編碼區(qū)。不同點：原核細胞基因的編碼區(qū)是連續(xù)的；真 核細胞的編碼區(qū)是間隔的，不連續(xù)的。啟動子：位于段能與結(jié)合并能起始合成的序列。沒有啟動子，基因就不能轉(zhuǎn)錄。RNA聚合酶:能夠識別的結(jié)合位點并與其結(jié)合的一種終止子：位于一段特殊的DNA片斷，它能阻

2、礙的移動，并使其從DNA模板鏈上脫離下來，使轉(zhuǎn)錄終止外顯子：真核細胞基因DNA中的序列，這些序列被轉(zhuǎn)錄成RNA并進而翻譯為蛋白質(zhì)。內(nèi)含子：真核細胞基因DNA中的_序列，這些序列被轉(zhuǎn)錄成RNA,但隨即被剪除而不翻譯。目的基因的概念主要是指編碼基因，也可以是一些具有調(diào)控作用的因子 例如：與生物抗逆性相關(guān)的基因，與生物優(yōu)良品質(zhì)相關(guān)的基因，藥物和保健品相關(guān)的基因，與毒物降解相關(guān)的基因，以及與工業(yè)所需要酶相關(guān)的基因。目前被廣泛提取使用的目的基因有：、目的基因的獲取的方法（用到哪些工具？）（1）從基因庫中獲取目的基因基因文庫和部分基因文庫的慨念將含有某種生物不同基因的許多DNA片段，導(dǎo)入受體菌的群體中儲存

3、，各個受體菌分別含有 這種生物的不同的基因，稱為基因文庫。部分基因文庫的建立方法基因組文庫的建立方法部分基因文庫的建立方法基因組文庫的建立方法mRNAk轉(zhuǎn)錄酶單鏈DNAI合成雙鏈 DNA ( cDNA mRNAk轉(zhuǎn)錄酶單鏈DNAI合成雙鏈 DNA ( cDNA )插入cDNA 文庫)提取某種生物的全部DNA|用適當?shù)南拗泼该盖幸欢ù笮〉?DNA片段|將DNA片段與運載體連接導(dǎo)入受體菌中儲存（基因組文庫）|分離目的基因文庫類型cDNA文庫基因組文庫文庫大小基因中啟動子（具有啟動作用 的DNA片段）基因中內(nèi)含子（位于編碼蛋白 質(zhì)序列的非編碼DNA片段）基因多少物種間的基因父流基因組文庫和cDNA文

4、庫的主要區(qū)別（2）應(yīng)用PCR技術(shù)擴增目的基因定義：PCR是.是一項在復(fù)制特定DNA片段的核酸合成技術(shù)，在短時間內(nèi)大量擴增目的基因原理：DNA分子熱變性（在9095 0C時，解旋，雙鏈分開溫度降低又結(jié)合成雙鏈）因此，在PCR技術(shù) 中不需要 （與復(fù)制不同之在處）儀器：PCR擴增儀（自動調(diào)控溫度的儀器）條件：作為模板的序列DNA引物（20個左右堿基的短DNA單鏈）；Taq；dNTP （dATP, dTTP, dGTP和 dCTP）。過程：Step 1.DNA熱變性（9095 0C）：雙鏈DNA模板在熱的作用下，氫鍵斷裂形 一般需要30秒一1.5分鐘Step 2.復(fù)性或退火（5560 0C）：系統(tǒng)溫度

5、降低，結(jié)合到互補DNA鏈上，形成局部的雙鏈DNA。需要30秒Step 3.延伸（7075 0C）：在酶作用下，合成與模板互補的DNA子鏈，形 Step 4重復(fù)1.2.3步驟：每重復(fù)一次，目的基因增加一倍一般Taq酶每分鐘合成DNA長度lOOObp,所以擴增一個長度為1500bp對的特異DNA2. 5分鐘， 75分鐘即可擴增出230個。Q 怎樣從基因文庫中找到我們所需要的目的基因2 根據(jù)目的基因的有關(guān)信息，例如，根據(jù)基因的核背酸序列、基因的功能、基因在染色體 上的位置、基因的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物mRNA,以及基因的表達產(chǎn)物蛋白質(zhì)等特性來獲取目的基因。Southern印跡雜交（基因探針原來）的基本步驟待測核酸

6、樣品的制備： 探針標記:Southern 雜交: 放射性自顯影檢測:（3）用化學方法直接人工合成目的基因蛋白質(zhì)氨基酸序列一niRNA的核背酸序列一目的基因序列一目的基因 針對：基因比較小，核背酸序列又已知思考：人工合成的目的基因是否具有完整基因結(jié)構(gòu)的基因？二.基因表達載體的構(gòu)建核心(用到哪些工具)1作用：使目的基因在受體細胞中同時使目的基因能和發(fā)揮作用。組成：(1)目的基因：啟動子：終止子：標記基因：是鑒別受體細胞中是否含有從而將含有目的基因的細胞篩選出來罷1-E聶達孫煉出氏田罷1-E聶達孫煉出氏田質(zhì)粒DNA分子J同一種限制酶處理 |一個切口兩個切口兩個黏性末端獲得目的基因DNA連接酶重組DN

7、A分子(重組質(zhì)粒)實際操作過程是用兩種限制酶分別處理目的基因和質(zhì)粒？原因： 三、將目的基因?qū)胧荏w細胞1轉(zhuǎn)化：目的基因進入受體細胞內(nèi)，并且在受體細胞內(nèi)維持穩(wěn)定和表達的工程常見轉(zhuǎn)化方法：(1)將目的基因?qū)胫参锛毎r(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化法：雙子葉植物和裸子植物。資料：農(nóng)桿菌是一種在土壤中生活的微生物，能在自然條件下感染雙子葉植物和裸子植物， 而對大多數(shù)單子葉植物沒有感染能力。當植物體受到損傷時，傷口處的細胞會分泌大量的 酚類化合物，吸引農(nóng)桿菌移向這些細胞，這時農(nóng)桿菌中的Ti質(zhì)粒上的T-DNAC可轉(zhuǎn)移的DNA) 可轉(zhuǎn)移至受體細胞，并且整合到受體細胞染色體的 DNA上。根據(jù)農(nóng)桿菌的這種特點，如果 將目的基因插入

8、到Ti質(zhì)粒的T-DNA ，通過農(nóng)桿菌的轉(zhuǎn)化作用，就可以使目的基因進入植 物細胞，并將其插入到植物細胞中染色體的DNA ,使目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持 和表達。它是將目的基因?qū)胫参锛毎捎米疃嗟姆椒ā?yōu)點該轉(zhuǎn)化體系是模仿或稱之為利用天然的轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)，成功率高，效果好農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)的機理研究得最清楚,方法最成熟，應(yīng)用也最廣泛；農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)轉(zhuǎn)化的外源基因以單拷貝為多數(shù)，遺傳穩(wěn)定性好，并且多數(shù)符合孟德爾遺傳規(guī)律? ，因此轉(zhuǎn)基因植株能較好地為育種提供了中間選育材料;農(nóng)桿菌Ti質(zhì)粒轉(zhuǎn)化系統(tǒng)操作比較容易，需要的儀器設(shè)備簡單，易于推廣。農(nóng)桿菌特點：易感染植物和裸子植物，對植物沒有感染

9、力；Ti質(zhì)粒的可轉(zhuǎn)移至受體細胞，并整合到受體細胞的染色體上。四目的基因的檢測與鑒定檢杳是否成功(1 )檢測轉(zhuǎn)基因生物染色體的目的基因方法：DNA 分子雜交技術(shù)基因探針：放射性同位素等標記的DNA 上是否插入了DNA 分子探針轉(zhuǎn)基因生 物的 DNA15 n變性 -15 N14 N 探針轉(zhuǎn)基因生 物的 DNA15 n變性 -15 N14 N ：變性14 N花粉管通道法 這是我國科學家獨創(chuàng)的一種方法，是一種十分簡便經(jīng)濟的方法(我的的轉(zhuǎn)基因抗蟲棉就是用此 種方法獲得的)。植物花粉在柱頭上萌發(fā)后，花粉管要穿過花柱直通胚囊?；ǚ酃芡ǖ婪ň褪窃?植物受粉后，花粉形成的花粉管還未愈合前，剪去柱頭，然后，滴加D

10、NA (含目的基因)，使目 的基因借助花粉管通道進入受體細胞?；驑尫ǎ簡巫尤~植物。 是單子葉植物中常用的一種基因轉(zhuǎn)化方法，但是成本較高。(2)將目的基因?qū)雱游锛毎@微注射法受體細胞類型：.(2)檢測目的基因是否轉(zhuǎn)錄出了mRNA探針方法:轉(zhuǎn)基因生物 的 mRNADNA 分子雜交技術(shù)15 N變性15 N14 N14 N如果顯示出雜交帶，就表明待測樣品目的基因已經(jīng)轉(zhuǎn)錄。轉(zhuǎn)化過程：目的基因插 叱 農(nóng)桿菌一導(dǎo)入植物細胞一目的基因整合到植物細胞染色體上一目的基因的遺傳特性得以穩(wěn)定維持和表達。槍測 目的舉因是否蒯詳成更白應(yīng)1明=槍測 目的舉因是否蒯詳成更白應(yīng)1明=白白 操作程序：提純含目的基因表達載體取

11、受精卵(體內(nèi)或體外受精)f顯微注射 f培養(yǎng)成早期胚胎一移植到子宮或輸卵管f發(fā)育成新性狀動物(轉(zhuǎn)基因動物)(3)將目的基因?qū)胛⑸锛毎?感受態(tài)細胞法。微生物作受體細胞原因：常用菌：常用法：過程：Ca2+Ca2+處理感受態(tài) 表達載體與感受片感受態(tài)細胞大腸桿菌細胞態(tài)細胞混合吸收DNA2.鑒定個體生物學水平的鑒定抗蟲、抗病接種實驗，活性比較實驗(1)多細胞個體例：用棉鈴飼喂棉鈴蟲，如蟲吃后不出現(xiàn)中毒癥狀，說明未攝入目的基因或攝入目的基因未表達。如蟲吃后中毒死亡，則說明攝入了抗蟲基因并得到表達。(2)單細胞生物細菌的檢測，將每個受體細胞單獨培養(yǎng)形成菌落，檢測菌落中是否有目的基因的表達產(chǎn)物。淘汰無表達產(chǎn)

12、物的菌落，保留有表達產(chǎn)物的進一步培養(yǎng)、研究。 課堂訓練1.下列有關(guān)基因工程的敘述，正確的是A. DNA連接酶的作用是將兩個黏性末端的堿基連接起來B.目的基因?qū)?體細胞后，受體細 發(fā)生基因突變 C.目的基因與運載 合的過程發(fā)生在細D.常使用的運 有大腸桿菌、噬菌 動植物病毒等 2.某質(zhì)粒上有Sal HindllR BamH I 三 制酶切割位點，同 含有抗四環(huán)素基因 氨節(jié)青霉素基因。入受 胞即體結(jié) 胞外載體 體和請回爺列低題。I 、種限時還 和抗 利用此質(zhì)粒獲得轉(zhuǎn)基因抗鹽煙草的過程如圖所示,抗內(nèi)坷草甚圍1/ndllJ 41 Sai I得到轉(zhuǎn)基黠物2亦煙弟陽倉催化連催化連(1)將含有目的基因的DNA與質(zhì)粒分別用Sal I酶切，酶切產(chǎn)物用接后，兩個DNA片段的連接結(jié)果有種。(2)在構(gòu)建重組質(zhì)粒時，應(yīng)選用兩種酶對進行切割，以保證重組DNA序列的唯一性。 為篩選出導(dǎo)入了重組質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，應(yīng)在培養(yǎng)基中加入,理由是0將轉(zhuǎn)入抗鹽基因的煙草細胞培育成完整的植株需要用技術(shù)，愈傷組織經(jīng)進而形成完整植株，此過程除營養(yǎng)物質(zhì)外還必須向培養(yǎng)基中添加03、根據(jù)基因工程的有關(guān)內(nèi)容在下列橫線上