水糞大腸菌數(shù)檢測(cè)(業(yè)內(nèi)借鑒)課件

1、09工業(yè)環(huán)保與安全技術(shù)水總大腸菌群檢測(cè)09工業(yè)環(huán)保與安全技術(shù)水總大腸菌群檢測(cè)工作流程實(shí)驗(yàn)工作流程實(shí)驗(yàn)理論知識(shí)講解儀器使用說(shuō)明書(shū)安全注意事項(xiàng)2專業(yè)課件工作流程實(shí)驗(yàn)工作流程實(shí)驗(yàn)理論知識(shí)講解儀器使用說(shuō)明書(shū)安全注意事工作流程實(shí)驗(yàn)流程分組取樣依單卡領(lǐng)物品實(shí)驗(yàn)返還物品提交報(bào)告3專業(yè)課件工作流程實(shí)驗(yàn)流程分組取樣依單卡領(lǐng)物品實(shí)驗(yàn)返還物品提交報(bào)告3專 當(dāng)環(huán)境受到污染后，環(huán)境的 物理性質(zhì) 化學(xué)性質(zhì) 生物學(xué)特性 如：重金屬離子、NO3- 濃度增加；水體污染變質(zhì)，水生生物種類減少，甚至滅絕；發(fā)生變化理論知識(shí)4專業(yè)課件 當(dāng)環(huán)境受到污染后，環(huán)境的發(fā)生變化理論知識(shí)4專業(yè)課件如何監(jiān)測(cè)？化學(xué)方法：快速、定性定量反映污染物濃度，

2、但為瞬時(shí)值； 生物學(xué)方法：利用生物種類、數(shù)量的變化，生物學(xué)特性的改變來(lái)監(jiān)測(cè)污染物對(duì)環(huán)境的影響?？杀O(jiān)測(cè)到污染物對(duì)環(huán)境的綜合影響，但不易精確反映污染物的性質(zhì)、濃度和數(shù)量。5專業(yè)課件如何監(jiān)測(cè)？化學(xué)方法：快速、定性定量反映污染物濃度，但為瞬時(shí)值生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)2006年12月29日，衛(wèi)生部、國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)化委員會(huì)發(fā)布2006年第12號(hào)文件，批準(zhǔn)發(fā)布生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)及檢測(cè)方法國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。標(biāo)準(zhǔn)自2007年7月1日起實(shí)施，其中生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)中非常規(guī)指標(biāo)的實(shí)施項(xiàng)目和日期由省級(jí)人民政府根據(jù)當(dāng)?shù)貙?shí)際情況確定。全部指標(biāo)最遲于2012年7月1日實(shí)施。6專業(yè)課件生活飲用水衛(wèi)生標(biāo)準(zhǔn)2006年12月29日，衛(wèi)生部、國(guó)家標(biāo)飲

3、用水中微生物指標(biāo)項(xiàng)目單位限值說(shuō)明總大腸菌群MPN/100mL或CFU/100mL不得檢出一般性污染耐熱大腸菌群MPN/100mL或CFU/100mL不得檢出指示糞便污染大腸埃希氏菌MPN/100mL或CFU/100mL不得檢出指示糞便污染菌落總數(shù)CFU/mL100一般性污染賈第鞭毛蟲(chóng)個(gè)/10 L1腸道原蟲(chóng)隱孢子蟲(chóng)個(gè)/10 L1腸道原蟲(chóng)7專業(yè)課件飲用水中微生物指標(biāo)項(xiàng)目單位限值說(shuō)明總大腸菌群MPN/100m新國(guó)標(biāo)常規(guī)項(xiàng)目限值變化原國(guó)標(biāo)新國(guó)標(biāo)砷0.05 mg/L0.01 mg/L鎘0.01 mg/L0.005 mg/L鉛0.05 mg/L0.01 mg/L硝酸鹽（以N計(jì)）20 mg/L10 mg/L

4、濁度3度1NTU8專業(yè)課件新國(guó)標(biāo)常規(guī)項(xiàng)目限值變化原國(guó)標(biāo)新國(guó)標(biāo)砷0.05 mg/L0.0 檢品 膽鹽乳糖發(fā)酵管 伊紅美蘭平板 大腸桿菌菌落純培養(yǎng) 乳糖復(fù)發(fā)酵管（-） 乳糖復(fù)發(fā)酵管（） 大腸菌群的檢測(cè)流程9專業(yè)課件大腸菌群的檢測(cè)流程9專業(yè)課件總大腸菌群當(dāng)飲用水受到糞便等污染，就有可能帶有沙門(mén)氏菌、志賀氏菌、弧菌、腸道病毒等，且它們均可以水為媒介引起腸道傳染病。總大腸菌群含量可表明水體被污染的程度，并且間接地表明腸道病菌存在的可能，以及對(duì)人體健康具有潛在危險(xiǎn)性。 10專業(yè)課件總大腸菌群當(dāng)飲用水受到糞便等污染，就有可能帶有沙門(mén)氏菌、志賀糞大腸菌群糞大腸菌為總大腸菌群的一個(gè)亞種；直接來(lái)自糞便，除了它耐熱

5、，在44-44.5的高溫條件下仍可生長(zhǎng)繁殖并將色氨酸代謝成吲哚，其他特性均與總大腸菌群相同。由于總大腸菌群既包括糞便污染，同時(shí)也包括非糞便污染的大腸菌總數(shù)，因此，有必要在飲用水標(biāo)準(zhǔn)中增加糞大腸菌群這個(gè)指標(biāo)，以便直接反映出水體是否受到糞便污染的信息，進(jìn)一步確保流行病學(xué)的安全。11專業(yè)課件糞大腸菌群糞大腸菌為總大腸菌群的一個(gè)亞種；直接來(lái)自糞便，除了糞大腸菌群檢測(cè)方法注解 總大腸菌群中的細(xì)菌除生活在腸道中外，在自然環(huán)境中的水與土壤中也經(jīng)常存在，但此等在自然環(huán)境中生活的大腸菌群培養(yǎng)的最合適溫度為25左右，如在37培養(yǎng)則仍可生長(zhǎng)，但如將培養(yǎng)溫度再升高至44.5，則不再生長(zhǎng)，而直接來(lái)自糞便的大腸菌群細(xì)菌，

6、習(xí)慣于37左右生長(zhǎng)，如將培養(yǎng)溫度升高至44.5仍可繼續(xù)生長(zhǎng)。 因此，可用提高培養(yǎng)溫度方法將自然環(huán)境中的大腸菌群與糞便中的大腸菌群區(qū)分。在37培養(yǎng)生長(zhǎng)的大腸菌群，包括在糞便內(nèi)生長(zhǎng)的大腸菌群稱為“總大腸菌群”(Total coliform)；在44.5仍能生長(zhǎng)的大腸菌群，稱為“糞大腸菌群”(Fecal coliform)，糞大腸菌群細(xì)菌在衛(wèi)生學(xué)上具有重要的意義。12專業(yè)課件糞大腸菌群檢測(cè)方法注解 總大腸菌群中的細(xì)菌除生活在目的：1.學(xué)習(xí)水樣的采取方法和水樣總大腸菌菌群測(cè)定的方法；2.了解水源水的平板菌落計(jì)數(shù)的原則。13專業(yè)課件目的：1.學(xué)習(xí)水樣的采取方法和水樣總大腸菌菌群測(cè)定的方法；1水中總大腸菌

7、群的測(cè)定一、測(cè)定意義 作為水體受糞便污染的指標(biāo)。 二、總大腸菌群的特征 在37 48h之內(nèi)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣 是革蘭氏陰性無(wú)芽孢桿菌 在特殊培養(yǎng)基上能夠長(zhǎng)出具有典型特征的菌落 14專業(yè)課件水中總大腸菌群的測(cè)定一、測(cè)定意義 作為水體受糞便污染的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)原理：目前檢測(cè)大腸菌群的標(biāo)準(zhǔn)分析法是多管發(fā)酵法。多管發(fā)酵法包括初步發(fā)酵試驗(yàn)，平板劃線分離和復(fù)發(fā)酵試驗(yàn)三部分。15專業(yè)課件實(shí)驗(yàn)原理：目前檢測(cè)大腸菌群的標(biāo)準(zhǔn)分析法是多管發(fā)酵法。15專業(yè) 水中總大腸菌群的測(cè)定 總大腸菌群:指那些能在37 48h之內(nèi)發(fā)酵乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的、需氧及兼性厭氧的革蘭氏陰性的無(wú)芽孢桿菌。主要包括有埃希氏菌屬、檸檬酸桿菌屬、腸桿菌屬、克

8、雷伯氏菌屬等菌屬的細(xì)菌。 生活飲用水的總大腸菌群數(shù)每升不得超過(guò)3個(gè)16專業(yè)課件 水中總大腸菌群的測(cè)定 總大腸菌群:指那些能在37 48h水中總大腸菌群的測(cè)定一、多管發(fā)酵法 (1) 生活飲用水 初發(fā)酵試驗(yàn) 平板分離 復(fù)發(fā)酵試驗(yàn) 陽(yáng)性管接種在伊紅美蘭培養(yǎng)基上，37培養(yǎng)1824h，挑選典型特征的菌落，涂片、革蘭氏染色、鏡檢 各100mL原水樣各10mL3724hG-G-G+3718-24h3724h17專業(yè)課件水中總大腸菌群的測(cè)定一、多管發(fā)酵法 (1) 生活飲用水 (2) 水源水：將水樣作1：10稀釋 水樣25mL225mL無(wú)菌水各1mL各1mL各10mL10-13724h水源水大腸菌群的測(cè)定18專

9、業(yè)課件(2) 水源水：將水樣作1：10稀釋 水樣25mL225mL(3) 地表水和廢水：水樣應(yīng)作1:10，1:100，1:1000或更高的稀釋 MPN值=MPN指數(shù) 水源水大腸菌群的測(cè)定19專業(yè)課件(3) 地表水和廢水：水樣應(yīng)作1:10，1:100，1:10水源水大腸菌群的測(cè)定1.初發(fā)酵試驗(yàn) 水樣25mL225mL無(wú)菌水各1mL各1mL各10mL10-1EC培養(yǎng)液3724h44.52448h20專業(yè)課件水源水大腸菌群的測(cè)定1.初發(fā)酵試驗(yàn) 水樣25mL225mL無(wú)2.復(fù)發(fā)酵試驗(yàn) 陽(yáng)性管接到EC培養(yǎng)液中。在37溫度下培養(yǎng)24h2h，立即觀察，發(fā)酵管產(chǎn)氣則證實(shí)為大腸菌群陽(yáng)性 3.計(jì)算和報(bào)告結(jié)果 查M

10、PN表，按總大腸菌群的計(jì)算方法計(jì)算每升水中糞大腸菌群細(xì)菌的MPN值 水源水大腸菌群的測(cè)定21專業(yè)課件2.復(fù)發(fā)酵試驗(yàn) 陽(yáng)性管接到EC培養(yǎng)液中。在37溫度下培養(yǎng)2檢測(cè)操作方法檢品取樣培養(yǎng)基配制滅菌與消毒接種培養(yǎng)與計(jì)數(shù)22專業(yè)課件檢測(cè)操作方法檢品取樣培養(yǎng)基配制滅菌與消毒接種培養(yǎng)與計(jì)數(shù)22專檢品取樣1.水體取樣： 應(yīng)取距水面1015cm的深層水樣。先將滅菌的帶玻璃塞瓶，瓶口向下浸入水中，然后翻轉(zhuǎn)過(guò)來(lái)，除去玻璃塞，水立即流入瓶中，盛滿后，將瓶塞蓋好，再?gòu)乃腥〕觥?. 自來(lái)水取樣： 打開(kāi)自來(lái)水龍頭，讓水流流出1min左右，用燒杯接取自來(lái)水。23專業(yè)課件檢品取樣1.水體取樣：23專業(yè)課件3. 將河水水樣分

11、別稀釋成10-1、10-2、10-3三個(gè)連續(xù)稀釋濃度（注意：在稀釋前后一定要充分混勻）、自來(lái)水樣不稀釋。 注意：河水樣的稀釋，取1個(gè)滅菌空試管，加入9mL滅 菌水。用取過(guò)滅菌水的移液管取1mL河水樣，放入試管中，振蕩試管混合均勻。 檢品取樣24專業(yè)課件3. 將河水水樣分別稀釋成10-1、10-2、10-3三個(gè)連或者是品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基。生長(zhǎng)特征菌落。發(fā)酵（產(chǎn)酸產(chǎn)氣）EC肉湯配方：胰蛋白胨20g/l乳糖5g/l3號(hào)膽鹽1.5g/lK2HPO4 4g/lKH2PO4 1.5g/lNaCl 5g/lpH：7.0初發(fā)酵（產(chǎn)酸產(chǎn)氣）EC肉湯伊紅美蘭培養(yǎng)基3倍EC肉湯培養(yǎng)基配制25專業(yè)課件或者是品紅亞硫酸

12、鈉培養(yǎng)基。生長(zhǎng)特征菌落。發(fā)酵（產(chǎn)酸產(chǎn)氣）初發(fā)品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基（Endo Agar）（遠(yuǎn)藤瓊脂培養(yǎng)基）26專業(yè)課件品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基（Endo Agar）（遠(yuǎn)藤瓊脂培養(yǎng)基）2品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基平板及典型菌落27專業(yè)課件品紅亞硫酸鈉培養(yǎng)基平板及典型菌落27專業(yè)課件伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基 蛋白胨 10g乳糖 10g磷酸氫二鉀 2g瓊脂 2030g蒸餾水 1000ml2%伊紅水溶液 20ml0.5 %美藍(lán)水溶液 13ml 28專業(yè)課件伊紅美藍(lán)培養(yǎng)基 蛋白胨 10g28專業(yè)課件滅菌與消毒滅菌1.無(wú)菌操作中需要用到的器具需滅菌，如取樣瓶、培養(yǎng)皿、涂布棒等；2.培養(yǎng)基需滅菌；3.無(wú)菌水需滅菌。消毒1.接種前，空氣

13、環(huán)境需紫外線消毒；2.無(wú)菌操作時(shí)，手需酒精消毒29專業(yè)課件滅菌與消毒滅菌1.無(wú)菌操作中需要用到的器具需滅菌，如取樣瓶、1.加熱已經(jīng)配制好的固體培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基），使固體培養(yǎng)基溶化。2.倒制平板：每個(gè)空平皿中倒約20mL的培養(yǎng)基，放置桌面待其凝固。3.用移液管吸取0.1mL水樣，滴于平板中；將玻璃涂布棒于酒精燈的外焰上加熱，殺死表面微生物，待其冷卻后用涂布棒將水滴均勻的涂滿整個(gè)平板表面，盡量將水涂干。5. 倒置于37度培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。涂布平板接種法：30專業(yè)課件1.加熱已經(jīng)配制好的固體培養(yǎng)基（牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基），使涂布平板接種法：31專業(yè)課件涂布平板接種法：31專業(yè)課件

14、1.挑取無(wú)片狀菌苔生長(zhǎng)的平板作為計(jì)數(shù)平板，若片狀菌苔的大小不到平板的一半，而其余的一半菌落分布很均勻時(shí)，可將此一半的菌落數(shù)乘2以代表全平板的菌落數(shù)。 2.選擇平均菌落數(shù)在30-300之間的平板來(lái)計(jì)算該水樣的菌落總數(shù)。如果所有的平板的菌落總數(shù)都不在30-300范圍之內(nèi)，則取最靠近30-300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù) 3. 如果有兩個(gè)稀釋濃度的總菌落數(shù)落在了30-300范圍之內(nèi)，則先計(jì)算兩個(gè)濃度下每ml水體中細(xì)菌總數(shù)，如果兩個(gè)數(shù)值的比值大于2則取小的濃度，如若小于2則取兩值的平均值。菌落計(jì)數(shù)32專業(yè)課件菌落計(jì)數(shù)32專業(yè)課件33專業(yè)課件33專業(yè)課件10-110-210-3細(xì)菌總數(shù)（個(gè)/mL)156215213

15、246822640261321856無(wú)法計(jì)數(shù)354731928104無(wú)法計(jì)數(shù)30312試一試 34專業(yè)課件10-110-210-3細(xì)菌總數(shù)15621521324682例次不同稀釋度的平均菌落數(shù)兩個(gè)稀釋度菌落數(shù)之比菌落總數(shù)/CFUmL-1報(bào)告方式/ CFUmL-110-110-210-31234561 3652 7602 890無(wú)法計(jì)算27無(wú)法計(jì)算1642952711 650113052046605135121.62.216 40037 75027 100513 00027030 50016 000或1.610438 000或3.810427 000或2.7104510 000或5.110527

16、0或2.710231 000或3.1104計(jì)算和報(bào)告計(jì)數(shù)結(jié)果 35專業(yè)課件例次兩個(gè)稀釋度菌落總數(shù)/CFUmL-1報(bào)告方式/ CFU計(jì)算根據(jù)證實(shí)有大腸菌群存在的陽(yáng)性發(fā)酵管，查MPN檢索表，求出每100ml水樣中的大腸菌群數(shù)。MPN表見(jiàn)P19236專業(yè)課件計(jì)算根據(jù)證實(shí)有大腸菌群存在的陽(yáng)性發(fā)酵管，查MPN檢索表，求出大腸菌群測(cè)定 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)采用三步法 大腸菌群 需氧及兼性厭氧、在37能分解乳糖產(chǎn)酸產(chǎn)氣的革 蘭氏陰性無(wú)芽胞桿菌。 乳糖發(fā)酵試驗(yàn)分離培養(yǎng)證實(shí)試驗(yàn)樣品稀釋后，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三管乳糖膽鹽發(fā)酵管。361培養(yǎng)482h，觀察是否產(chǎn)氣。 將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于伊紅美藍(lán)瓊脂平板上，361

17、培養(yǎng)18-24h，觀察菌落形態(tài)。挑取平板上的可疑菌落，進(jìn)行革蘭氏染色觀察。同時(shí)接種乳糖發(fā)酵管361培養(yǎng)242h，觀察產(chǎn)氣情況。 根據(jù)證實(shí)為大腸桿菌陽(yáng)性的管數(shù)，查MPN表，報(bào)告每100ml（g）大腸菌群的MPN值。 37專業(yè)課件大腸菌群測(cè)定 國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)采用三較清潔樣品的三步法圖示 100mL50mL三倍濃縮乳糖蛋白胨培養(yǎng)液100mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL5mL水樣10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL10mL38專業(yè)課件較清潔樣品的三步法圖示 100mL50mL三倍濃縮乳糖蛋白胨三步法圖示 取產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管中培養(yǎng)液在伊紅美蘭平板上

18、進(jìn)行劃線取有核心和帶金屬光澤的深紫色菌落進(jìn)行革蘭氏染色乳糖蛋白胨培養(yǎng)液鏡檢（革蘭氏陰性菌）37 培養(yǎng)48h證實(shí)產(chǎn)氣（陽(yáng)性）結(jié)果與否37 培養(yǎng)24h37培養(yǎng)24h 39專業(yè)課件三步法圖示 取產(chǎn)酸產(chǎn)氣的發(fā)酵管中培養(yǎng)液在伊紅美蘭平板上進(jìn)行劃大腸菌群測(cè)定 計(jì)算方法 挑選菌落特征：黑紫色、有光澤或無(wú)光澤菌落； 紅色、粉紅色菌落。抑制劑：膽鹽、煌綠、十二烷基硫酸鈉。 為陰性結(jié)果的水樣體積（mL）全部水樣體積（mL） MPN 1000為陽(yáng)性結(jié)果的發(fā)酵管（瓶）的數(shù)目 產(chǎn)酸判斷：紫色培養(yǎng)液變成黃色產(chǎn)氣判斷：發(fā)酵導(dǎo)管內(nèi)有小氣泡，如輕輕打動(dòng)試管有氣泡沿管壁 上浮，應(yīng)考慮可能有氣體產(chǎn)生，需進(jìn)一步試驗(yàn)。 40專業(yè)課件大腸菌群測(cè)定 計(jì)算方法 挑選菌落特征：黑紫色、有光澤或無(wú)光澤美國(guó)FDA標(biāo)準(zhǔn)方法行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)采用兩步法：用于對(duì)出口食品中大腸菌群進(jìn)行檢驗(yàn) 推測(cè)試驗(yàn)證實(shí)試驗(yàn)樣品稀釋后，選擇三個(gè)稀釋度，每個(gè)稀釋度接種三管LST肉湯發(fā)酵管。361培養(yǎng)482h，觀察是否產(chǎn)氣。 將產(chǎn)氣發(fā)酵管培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于煌綠乳糖膽鹽（BGLB）肉湯中，361培養(yǎng)482h ，觀察是否產(chǎn)氣。以BGLB產(chǎn)氣為陽(yáng)性，查MPN表，報(bào)告每ml（g）樣品中大腸菌群的MPN值。 41專業(yè)課件美國(guó)FDA標(biāo)準(zhǔn)方法行業(yè)標(biāo)準(zhǔn)采用兩步法：用于對(duì)出口食品中大 如對(duì)一自來(lái)水廠出水進(jìn)行檢驗(yàn)，初發(fā)酵一般