蛋白質(zhì)關(guān)鍵工程講義

1、蛋白質(zhì)工程技術(shù)實(shí)驗(yàn)講義楊丙曄廈門醫(yī)學(xué)高等專科學(xué)校目 錄技術(shù)路線簡介與實(shí)驗(yàn)試劑準(zhǔn)備2學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)一 蛋白質(zhì)的原核誘導(dǎo)體現(xiàn)及SDS膠的配制4學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)二蛋白質(zhì)SDS電泳4學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)三電泳膠的染色3學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)四體現(xiàn)菌液的破碎和總蛋白的提取4學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)五體現(xiàn)蛋白濃度的測定3學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)六金屬螯合層析純化外源體現(xiàn)蛋白6學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)七純化蛋白的透析3學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)八組織蛋白的提取和電泳分離。3學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)九Western blotting8 學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)十蛋白質(zhì)組樣品的質(zhì)譜制備8學(xué)時(shí)實(shí)驗(yàn)一 蛋白質(zhì)的原核誘導(dǎo)體現(xiàn)及SDS膠的配制一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握蛋白質(zhì)日勺原核誘導(dǎo)體現(xiàn)及誘導(dǎo)機(jī)理2、熟悉SDS膠勺配制措施二、實(shí)驗(yàn)原理運(yùn)用乳糖勺類似物IPTG

2、對(duì)通過基因工程構(gòu)建好外援體現(xiàn)基因進(jìn)行蛋白勺誘 導(dǎo)體現(xiàn)，誘導(dǎo)勺原理為乳糖操縱子調(diào)控原理：乳糖操縱子勺構(gòu)成：大腸桿菌乳糖 操縱子含Z、Y、A三個(gè)構(gòu)造基因，分別編碼半乳糖苷酶、透酶和半乳糖苷乙酰轉(zhuǎn) 移酶，此外尚有一種操縱序列O, 一種啟動(dòng)子P和一種調(diào)節(jié)基因1。2、阻遏蛋白 勺負(fù)性調(diào)節(jié)：沒有乳糖存在時(shí)，I基因編碼勺阻遏蛋白結(jié)合于操縱序列O處，乳 糖操縱子處在阻遏狀態(tài)，不能合成分解乳糖勺三種酶；有乳糖存在時(shí)，乳糖作為 誘導(dǎo)物誘導(dǎo)阻遏蛋白變構(gòu)，不能結(jié)合于操縱序列，乳糖操縱子被誘導(dǎo)開放合成分 解乳糖勺三種酶。因此，乳糖操縱子勺這種調(diào)控機(jī)制為可誘導(dǎo)勺負(fù)調(diào)控。3. CAP 勺正性調(diào)節(jié)：在啟動(dòng)子上游有CAP結(jié)合位

3、點(diǎn)，當(dāng)大腸桿菌從以葡萄糖為碳源勺環(huán) 境轉(zhuǎn)變?yōu)橐匀樘菫樘荚瓷篆h(huán)境時(shí)，cAMP濃度升高，與CAP結(jié)合，使CAP發(fā)生變 構(gòu)，CAP結(jié)合于乳糖操縱子啟動(dòng)序列附近勺CAP結(jié)合位點(diǎn)，激活RNA聚合酶活性， 增進(jìn)構(gòu)造基因轉(zhuǎn)錄，調(diào)節(jié)蛋白結(jié)合于操縱子后增進(jìn)構(gòu)造基因勺轉(zhuǎn)錄，對(duì)乳糖操縱 子實(shí)行正調(diào)控，加速合成分解乳糖勺三種酶。4、協(xié)調(diào)調(diào)節(jié)：乳糖操縱子中勺I 基因編碼勺阻遏蛋白勺負(fù)調(diào)控與CAP勺正調(diào)控兩種機(jī)制，互相協(xié)調(diào)、互相制約。三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑1、菌種：原核體現(xiàn)菌株：大腸桿菌BL212、器材與試劑器材：低溫離心機(jī)，控溫?fù)u床，離心管。超凈工作臺(tái)，放錐形瓶勺搖床。試劑：LB培養(yǎng)基：胰蛋白月東10g，酵母提取物5g，氯

4、化鈉10g，pH調(diào)節(jié)到 7.2。121oC滅菌，20min；無水乙醇，新勺1.5ml離心管，1ml和200ul勺槍和槍頭。四、操作環(huán)節(jié)挑單菌落至1ml LB/Amp(50ug/ml)液體培養(yǎng)基，37C搖菌過夜按 1： 100 比例轉(zhuǎn)接到 LB/Amp (50ug/ml), 37C振蕩培養(yǎng) 2 4hrs培養(yǎng)屆時(shí)間后，取兩管1 mlH勺菌液離心收集剩余勺培養(yǎng)液加IPTG至終濃度0.5 1.0mM, 37C振蕩繼續(xù)培養(yǎng)之后每隔1h取樣一管，持續(xù)取誘導(dǎo)后4-5hrs樣品，剩余樣品收集細(xì)菌冷藏 備用。SDS膠勺配制：把玻璃板洗凈，用無水乙醇過一下，加快晾干。在灌膠裝置上把密封膠條放 好，玻璃板夾好，一定

5、要對(duì)平。配 5ml 10%分離膠(分離范疇 20 70kD)： 1.9ml ddH2O、1.7ml 30%Acr-Bis、 1.3ml 1.5MTis-Hcl(Ph8.8)、50ul 10%SDS 最后加 50ul 10%AP.3ul TEMED， 邊加邊混勻把分離膠用微量移液器沿一側(cè)夾層墊片灌進(jìn)夾層，注意槍頭不要用力壓玻璃 板。灌至液面離外層玻璃頂端約2.5cm加無水乙醇約0.5-1cm高30min后，膠凝固，有明顯勺折射線。倒掉水，用濾紙吸干配 2.5ml5 % 濃縮膠：1.7mlddH2O、 0.42ml30 % Acr-Bis、 0.31ml1.0MTis-Hcl(PH6.8)、25u

6、l 10%SDS 最后加 25ul 10%AP、2ul TEMED，灌膠至滿將梳子斜著下插，可以避免氣泡，插入約1cm約20 30min后凝固，小心拔 出梳子。實(shí)驗(yàn)二 蛋白質(zhì)SDS電泳一、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?、掌握運(yùn)用SDS+AGE電泳技術(shù)分析蛋白質(zhì)日勺體現(xiàn)狀況2、純熟掌握蛋白質(zhì)SDS膠勺配制以及電泳分離技術(shù)3、學(xué)習(xí)蛋白質(zhì)SDS電泳分離勺技術(shù)原理二、實(shí)驗(yàn)原理運(yùn)用SDS電泳技術(shù)對(duì)我們上節(jié)實(shí)訓(xùn)課所收集獲得菌液蛋白進(jìn)行分析， 分析誘導(dǎo)體現(xiàn)勺蛋白所體現(xiàn)勺趨勢與時(shí)間勺關(guān)系。SDS電泳原理：在電場 勺作用下，帶電粒子能在聚丙烯凝膠中遷移，其遷移速度與帶電粒子勺大小、構(gòu) 型和所帶勺電荷有關(guān)。十二烷基磺酸鈉（SDS）能

7、與蛋白質(zhì)勺結(jié)合，變化蛋白質(zhì) 原有勺構(gòu)象，使其變成近似于雪茄煙形勺長橢圓棒，其短軸長度同樣，而長軸與 分子量大小成正比。在SDS中，SDS-復(fù)合物勺遷移率不再受蛋白勺電荷和 形狀勺影響，而只與蛋白質(zhì)勺分子量正有關(guān)。在一定濃度勺凝膠中，由于分子篩 效應(yīng)，則電泳遷移率就成為蛋白質(zhì)分子量勺函數(shù)，實(shí)驗(yàn)證明分子量在15kD200 kD勺范疇內(nèi)，電泳遷移與分子量勺對(duì)數(shù)呈直線關(guān)系，用此法可根據(jù)已知分子量 白質(zhì)勺電泳遷移率和分子量勺對(duì)數(shù)做出原則曲線，再根據(jù)未知蛋白質(zhì)勺電泳遷移 率求得分子量。同步也可根據(jù)不同分離級(jí)分勺蛋白條帶勺多少來鑒定分離純化產(chǎn) 物勺純度。三、實(shí)驗(yàn)器材與試劑試劑：ddH2O、30%Acr-Bi

8、s、SDS, AP （過硫酸銨）、TEMED,甘氨酸，無水 乙醇，甲醇，乙酸。IxRunning Buffer （Tris甘氨酸電泳緩沖液）：1.5g Tris base、7.2g Glycine，溶 解后補(bǔ)水至500ml，在溶液中加入0.5g SDS樣品日勺準(zhǔn)備：樣品從冰箱中清除，在濾紙上倒置離心管充足流干，加入30ul日勺 PBS，加入30ul勺2XSDS上樣緩沖液，煮沸5min。3000rpm離心4min，輕輕 放置在桌子上。脫色液：甲醇：水：乙酸 二5： 4： 1兩組配100ml器材：新勺1.5ml離心管，1ml和200ul勺槍和槍頭，放錐形瓶勺搖床，電磁 爐，鍋，浮漂，培養(yǎng)皿，電泳儀

9、。四、操作環(huán)節(jié)SDS膠勺配制及電泳：把玻璃板洗凈，用無水乙醇過一下，加快晾干。在灌膠裝置上把密封膠條放 好，玻璃板夾好，一定要對(duì)平。配 5ml 10%分離膠（分離范疇 20 70kD）： 1.9ml ddH2O、1.7ml 30%Acr-Bis、 1.3ml 1.5MTis-Hcl（Ph8.8）、50|il 10%SDS 最后加 50|il 10%AP、3|il TEMED， 邊加邊混勻把分離膠用微量移液器沿一側(cè)夾層墊片灌進(jìn)夾層，注意槍頭不要用力壓玻璃 板。灌至液面離外層玻璃頂端約2.5cm加無水乙醇約0.5-1cm高30min后，膠凝固，有明顯勺折射線。倒掉水，用濾紙吸干配 2.5ml5 %

10、 濃 縮膠：1.7mlddH2O、 0.42ml30 % Acr-Bis、0.31ml1.0MTis-Hcl（PH6.8）、25|il 10%SDS 最后加 25l 10%AP2l TEMED，灌膠至滿將梳子斜著下插，可以避免氣泡，插入約1cm約20 30min后凝固，小心 拔出梳子。用bTris一甘氨酸電泳緩沖液沖洗并覆蓋。樣品日勺準(zhǔn)備，樣品從冰箱中清除，在濾紙上倒置離心管充足流干，加入30出 日勺PBS,加入30ul勺2XSDS上樣緩沖液，煮沸5min。3000rpm離心4min, 輕輕放置在桌子上。待樣品解決完畢，將膠板安到電泳槽中，灌bTris一甘氨酸電泳緩沖液，先 倒里面，沉沒上槽勺缽金電極，剩余勺倒入下槽用20到200ul勺槍取20 30ul樣品等體積加入加樣孔，速度要快，減少樣 品擴(kuò)散。剩余空樣品孔加入等體積bSDS凝膠加樣緩沖液80V電泳，等染料從濃縮膠進(jìn)入分離膠，將電壓調(diào)至130V，繼續(xù)電泳至染 料達(dá)到凝膠底部在裝有蒸餾水勺盆子中，小心把膠剝下。實(shí)驗(yàn)三電泳膠勺染色一、實(shí)驗(yàn)?zāi)可渍莆盏鞍踪|(zhì)電