蛋白表達(dá)及菌體破碎問(wèn)題

1、蛋白表達(dá)及菌體破碎問(wèn)題我最近做蛋白表達(dá)時(shí)，蛋白表達(dá)量尚可，但就是在超聲波碎菌時(shí)老是破不 碎，后來(lái) 做了相同條件下未誘導(dǎo)菌體進(jìn)行破碎，發(fā)現(xiàn)很容易破碎，請(qǐng)教列位大 俠這是怎么一回事 啊？我的具體操作如下：培養(yǎng)兩瓶200ml BL21 （ DE ） plysS4小時(shí),OD值0.9,對(duì)其中一瓶加 入IPTG置37度誘導(dǎo)表達(dá)，IPTG終濃度為O.lmmol/1,另一瓶保持不 變。誘導(dǎo)過(guò)夜，離心 收獲菌體，PES洗滌兩次后30ml PES懸浮菌體，超聲破碎3（）分鐘（5秒、9秒）， 保證冰浴。然后對(duì)菌體裂解液分別以600（）轉(zhuǎn)、12000轉(zhuǎn) 離心，SDS檢測(cè)，發(fā) 現(xiàn)目的蛋白&菌體蛋白絕大部分存在于6000

2、轉(zhuǎn)沉淀中，上清中只有很少菌體蛋白（誘導(dǎo) 后的）；而未誘導(dǎo)的則沉淀很少，且菌體蛋白大部分存在于上清中。請(qǐng)各位大俠幫小弟 看看是怎么回事？是不是因?yàn)槲业?蛋白表達(dá)影響到了菌體細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)了？可我的蛋白 應(yīng)該是包涵體表達(dá)啊，暈T!另外，在此前我做了大量的工作對(duì)菌體迸行破碎，包括反復(fù)凍融，溶菌酶，鹽酸月瓜（l- 3mol/L,我不想用太高濃度的，盡管可以），DOC, SKL還有一些文獻(xiàn)上介紹的一些裂解 液配方，均無(wú)法破碎，我簡(jiǎn)直要無(wú)語(yǔ)了！我最近在做蛋白表達(dá)用的是 PET和DE3我也有一些問(wèn)題不懂，希望可以 和你 一路探討學(xué)習(xí)。我表達(dá)的是分泌型蛋白，以下是我對(duì)你實(shí)驗(yàn)的拙見(jiàn)：1誘導(dǎo)的溫度是 否可以在重新調(diào)

3、超青的能量你用的多大的數(shù)值？是否在保證蛋白不變性的前提下，加大超青 條件， 超聲時(shí)間適當(dāng)可以延長(zhǎng)。直到菌液清亮透明（黃油狀）3取溶菌酶作用的最佳濃度，同時(shí)在反復(fù)凍融的過(guò)程中要不時(shí)的調(diào)節(jié) pH到它可以發(fā)揮 最大效力的數(shù)值破包涵體以尺其它方法的過(guò)程怎么樣？你用SDS檢測(cè)沉淀中的目的蛋白的分于量怎么樣？6蛋白表達(dá)影響菌體細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)這一問(wèn)題我也想知道誘導(dǎo)溫度我以前用的2（）度，后來(lái)發(fā)現(xiàn)37度誘導(dǎo)表達(dá)量較高就采用了 37度， 但對(duì)破碎效果的影響我正準(zhǔn)備再試試。我用的超聲儀屬于前輩級(jí)機(jī)器（但保證能用），我也不知道具體功率的大小，只知道 以往所用均為35% 45%,我用的是38%。超聲時(shí)間我延長(zhǎng)過(guò)，但誘導(dǎo)

4、后 的始終均是渾濁 菌體懸液。甚至有時(shí)發(fā)生分層，估計(jì)是變性了。溶菌酶我用的效應(yīng)濃度為lmg/ml, PH8.0, 37度水浴lh,不管用。不知道你一般用多少 濃度？溶菌酶能否與其它一些低濃度的離液劑或者去污劑聯(lián)用？?jī)鋈诜ㄒ灿眠^(guò)，-20-37度，3次，不管用。再者就是一些裂解液，效果實(shí)在 讓人郁 悶。SDS檢測(cè)沉淀中確實(shí)是目的蛋白，與全菌直接檢測(cè)分子量相同。不知 你對(duì)這 一點(diǎn)有什么想法？不知哪位大俠對(duì)蛋白表達(dá)是否會(huì)影響菌體胞壁結(jié)構(gòu)這一問(wèn)題不吝賜教？誘導(dǎo)溫度的選擇是以什么為標(biāo)準(zhǔn)(產(chǎn)量與表達(dá)蛋白的分離率)建議查文獻(xiàn) 核實(shí)2菌液離心后上清做 SDS檢測(cè)?？词欠裼心康牡鞍?，并收集。多次洗細(xì)菌沉淀 并重懸

5、細(xì)菌，超聲只破碎離心收集的細(xì)菌細(xì)胞(防止菌液內(nèi)已經(jīng)有的蛋白在超聲時(shí)與細(xì)菌 一起超聲變性發(fā)生分層)3超言破碎細(xì)菌細(xì)胞，并純化包含體后裂解釋放包涵體，離心收集上清跑電泳看是否有目的蛋白，有收集，并收集包含體，對(duì)其處理如下(包含體的處理是我在園于里找到的， 你在園于里搜索一下)10 000 r min - 1 離心 15 min，棄上清。將沉淀用3 mol - L-1尿素含0.2g- L-l TriionX2100反復(fù)洗滌處置取得純化的 包涵體，稱 重。包涵體用8 mol - L-1尿素含1() mmol - L-1二硫蘇糖醇(DTT)溶解變性。復(fù)性：包涵體溶解變性后10 OCX) r min-1離

6、心15 min，清除不溶性雜質(zhì)。上清直接用復(fù)性液:50 mmol - L-1 Tris Cl, 1 mmol - L-1 EPTA , 1 mmol L-1苯甲基磺酰氟 (PMSF)，不同濃度的氧化型谷胱甘肽(GSSG),還原型谷胱甘肽(GSH)稀釋，使蛋白質(zhì)終 濃度不超過(guò)100 mg - L-1,尿素終濃度為0. 5 1. 0 mol-L-1 ；在其他條件不變的情況下， 別離改變GSSG和GSH濃度、溫度尺復(fù)性 時(shí)間，PEG2()0()()濃縮后，離心。測(cè)上清總蛋白質(zhì)量，計(jì)算復(fù)性率，找出最佳復(fù)性條件。溶菌B lOmg/mlo在作用過(guò)程中菌液的pH會(huì)下將，所以最好多次重新調(diào)節(jié) pH8(你查一下

7、它的作用原理以尺大腸桿菌的特性就知道)凍融法我們是10次，最少六次6我感覺(jué)蛋白表達(dá)影響菌體細(xì)胞壁的結(jié)構(gòu)的可能性較小，主要還是包含體的處理上(我 也是新手)見(jiàn)笑了，供大家一起學(xué)習(xí)關(guān)于前輩級(jí)機(jī)器，如果前輩用可以，那么你應(yīng)該在自己漠漠條件了，1菌體破碎的檢測(cè)指標(biāo)：鏡檢，才可直觀知破全沒(méi)有？2反復(fù)凍融，溶菌酶，鹽酸弧(l-3mol/L,我不想用太高濃度的，盡管可以)，DOC, SKL還 有一些文獻(xiàn)上介紹的一些裂解液配方，均無(wú)法破碎？這些方法我都試過(guò)，菌是BL21 (DE3)均無(wú)問(wèn)題你不成功的原因可能在于細(xì)節(jié).未誘導(dǎo)的則沉淀很少，且菌體蛋白大部分存在于上清中結(jié)論是對(duì)的4.IPTG置37度誘導(dǎo)表達(dá)，IPT

8、G終濃度為lmmol/1, 3.545小時(shí)是最佳時(shí)間、再 長(zhǎng)則減 你可做單因于優(yōu)化.5.超肖破碎3()分鐘(5秒、9秒)，保證冰浴。然后對(duì)菌體裂解液分別以6()0()轉(zhuǎn)、120()0 轉(zhuǎn)離心，SDS檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)目的蛋白尺菌體蛋白絕大部分存在于6000轉(zhuǎn)沉淀中，上 清中只有很少菌體蛋白(誘導(dǎo)后的)結(jié)論正確，但還可優(yōu)化但要注意超聲的聲音，如聲音有異，則是沒(méi)有工作原因參數(shù)設(shè)置不對(duì)，產(chǎn)熱，溫度高， 間隔時(shí)間太短如還有問(wèn)題MSN伺名帳號(hào)，工作時(shí)間在線.謝謝的回答與建議。今明天我會(huì)再做一下IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，溫度20 度，IPTG 0.1mmol/Lo鏡檢或許是檢測(cè)菌體破碎的金指標(biāo)，但如果菌體有破碎，包含體是

9、不應(yīng)該在600()轉(zhuǎn) 沉淀下來(lái)啊，分級(jí)離心后電泳檢測(cè)應(yīng)該也可以說(shuō)明一點(diǎn)問(wèn)題。不過(guò)下面我會(huì)用鏡檢做一 下看。反復(fù)凍融、鹽酸孤(l-3mol/L)我重復(fù)過(guò)，確實(shí)不行。溶菌酶有可能是PH控制不好，我 會(huì)重做再試試。D()C我用2%,懸浮后能釋放核酸(懸液變粘稠)，但超言破碎效果確實(shí)不 行，我分別取了 2()分鐘、6()分鐘和9()分鐘的超聲裂解液電泳檢測(cè)。SKL效及其它只做 過(guò)一次，效果更差。IPTG誘導(dǎo)我做過(guò)優(yōu)化，終濃度()1和lmmol/L沒(méi)有太大區(qū)別，所以我一直用0.1。我一直搞不明白，同等超聲條件下為什么未誘導(dǎo)菌體可以很容易破碎，而誘導(dǎo)表達(dá)后就不容易破碎了呢？這應(yīng)該不是超言的原因吧，否則未誘

10、導(dǎo)的也不應(yīng) 該破碎啊1用不用溶菌酶都無(wú)多大關(guān)系，DOC用2%,懸浮后并不能釋放核酸，懸液變粘稠是由于DOC.3.IPTG誘導(dǎo)我做過(guò)優(yōu)化，終濃度().1和lmmol/L沒(méi)有太大區(qū)別，所以一直用0.1?優(yōu)化方法 不對(duì)同時(shí)做時(shí)間雙因于培養(yǎng)基多因于溫度20度可分泌表達(dá)，誘導(dǎo)過(guò)夜4破碎只用緩沖液即可包含體是不應(yīng)該在6000轉(zhuǎn)(4()000可沉淀80%你以前以為破菌不完全的原因：誘導(dǎo)時(shí)間太長(zhǎng)，沒(méi)有人在37度誘導(dǎo)過(guò)夜，這樣的話菌都已經(jīng)死了，而且都自溶T,所以你 離心收菌得到的已經(jīng)都是包涵體和少量沒(méi)有自溶的菌體，這樣無(wú)論怎么破菌上清里都沒(méi) 有多少菌體蛋白了。你的沒(méi)有加1PTG的對(duì)照就很正常，沒(méi) 有這種自溶現(xiàn)象

11、。不知道你的6000轉(zhuǎn)無(wú)法離心下來(lái)包涵體的概念是怎么來(lái)的。首先6000轉(zhuǎn)的說(shuō)法 就不科 學(xué)，應(yīng)該根據(jù)你使用的轉(zhuǎn)頭半徑大小換算成9,才能反映真實(shí)離心力大小，現(xiàn)在的新離心機(jī) 上都能直接看到go再說(shuō)一般的轉(zhuǎn)頭6000轉(zhuǎn)已經(jīng)能把大部分包涵體沉淀下來(lái)了，如果時(shí) 間夠長(zhǎng)，包涵體基本上都能沉淀下來(lái)。你的電泳照片顯示你的目的蛋白在包涵體6000轉(zhuǎn)已經(jīng)把90%以上的包涵體沉淀下來(lái)To 12000轉(zhuǎn)出現(xiàn)的兩條主要的雜帶我認(rèn)為不存在于包涵體里，而是位于細(xì)胞膜上的膜蛋 白，12()00轉(zhuǎn)(拜托換算成0把細(xì)胞膜的大碎片離心沉淀下 來(lái)了。建議只用6000轉(zhuǎn)離心下來(lái)的還算比較純的包涵體，扔掉12000轉(zhuǎn)的沉淀。1, 37度

12、誘導(dǎo)留宿致使菌體死亡破裂，不是因?yàn)槟愕膒lyss菌自身表達(dá)溶菌 酶的原 因，而是由于ipig的細(xì)胞毒性，一旦誘導(dǎo)，細(xì)胞的主要生理活動(dòng)都向著目的蛋白表達(dá)的 方面轉(zhuǎn)化。在通常情況下，細(xì)胞將停止生長(zhǎng)，形成克隆的能力大大降低，但并未死亡。 在37度環(huán)境中，34小時(shí)內(nèi)細(xì)胞都不會(huì)死亡。但是如果過(guò)夜誘導(dǎo)，在這樣的溫度和營(yíng)養(yǎng)已經(jīng)耗盡的情況下，細(xì)胞應(yīng)該會(huì)死掉一些，正 好你的plyss菌自身的溶菌酶會(huì)加速這個(gè)過(guò)程，所以才會(huì)出現(xiàn)你描述的情況。所以大家 在37度誘導(dǎo)時(shí)都是只誘導(dǎo)3-4小時(shí)。因?yàn)闆](méi)有人在37度誘導(dǎo)過(guò)夜，所以找不到根據(jù)支持我的觀點(diǎn)，你涂平板的結(jié)果也不太能 說(shuō)明問(wèn)題，我并沒(méi)有說(shuō)你的菌全部死掉了，不過(guò)你可以做一個(gè)稍微嚴(yán) 謹(jǐn)一點(diǎn)的試驗(yàn)來(lái)驗(yàn) 證一下我的推斷，在同樣的條件下37度過(guò)夜搖你的表達(dá)菌，一個(gè)加iptg, 一個(gè)不加，然 后分別稀釋到合適的濃度涂平板培養(yǎng)，計(jì)算活菌數(shù)，我估計(jì)將會(huì)有1到2個(gè)數(shù)量級(jí)的差 別。如果你看過(guò)包涵體的電鏡照片，你會(huì)發(fā)現(xiàn)包涵體還是很大個(gè)的，直徑跟細(xì)菌差不多，而且密度很大，肯定是可以在60()()轉(zhuǎn)離心下來(lái)的。你可以看看這個(gè)protocol，也 許對(duì)你的試驗(yàn)有幫助。他們就是600()轉(zhuǎn)離心包涵體，CuntriFugclocollect inclusion bodies (fbr example, 6000 rpm for 15 minu