熒光光譜技術(shù)

1、第二章熒光光譜技術(shù)16世紀(jì)，西班牙科學(xué)家Nicholas Monardes觀察到，貯放在由菲律賓紫檀木制成 的杯中的水會(huì)發(fā)出一種神奇而迷人的藍(lán)光。到17世紀(jì)，Boyle等其他科學(xué)家也觀察并 記載了類似的發(fā)光現(xiàn)象。1864年，英國(guó)物理學(xué)家George Stokes首先提出發(fā)光現(xiàn)象作 為一種分析方法，他在1852年發(fā)表的關(guān)于發(fā)光現(xiàn)象的基礎(chǔ)性論文以及隨后的一系列 研究工作，奠定了至今還在使用的許多發(fā)光概念的基礎(chǔ)。1978年，T.C. O,Hav在其 論文里對(duì)發(fā)光現(xiàn)象及研究做了歷史考證和評(píng)述（王鎮(zhèn)浦等,1989）。發(fā)光光譜法作為最 古老的分析方法之一，目前仍然得到極為廣泛的應(yīng)用。熒光光譜分析技術(shù)具有靈

2、敏度高（比紫外一可見分光光度法高23個(gè)數(shù)量級(jí)）， 選擇性好，工作曲線線性范圍寬，而且能夠提供激發(fā)光譜、發(fā)射光譜、發(fā)光強(qiáng)度、發(fā) 光壽命、量子產(chǎn)率、偏振和各向異性諸多信息等優(yōu)點(diǎn)，已經(jīng)成為一種重要的痕量分析 技術(shù)。它在生物、醫(yī)學(xué)、藥物、環(huán)境、石油工業(yè)等領(lǐng)域都有廣泛的應(yīng)用。隨著科學(xué)技 術(shù)的發(fā)展，激光、微機(jī)、電子學(xué)等新技術(shù)的引入，不僅大大推動(dòng)了熒光分析法在理論 上的發(fā)展，促進(jìn)了諸如時(shí)間分辨、相分辨、熒光偏振、熒光免疫、同步熒光、三維熒 光技術(shù)和熒光光纖化學(xué)傳感器、熒光光纖免疫傳感器等熒光分析新方法和新技術(shù)的發(fā) 展，同時(shí)促使各種新型熒光分析儀器的出現(xiàn)（王鎮(zhèn)浦等,1989;趙藻藩等,1990）。2.1光致發(fā)

3、光原理基本說來，光致發(fā)光是分子受光子激發(fā)后發(fā)生的一種去激發(fā)過程。在吸收紫外和 可見電磁輻射的過程中，分子受激躍遷到激發(fā)電子態(tài)。多數(shù)分子將通過與其他分子的碰撞，以熱的形式散發(fā)掉多余的這部分能量；部分分子則以光的形式釋放出這部分能 量，放射出光的波長(zhǎng)不同于所吸收輻射的波長(zhǎng)。后一種過程稱為光致發(fā)光。從本質(zhì)上 講，光致發(fā)光是一種涉及光子的激發(fā)一去激發(fā)過程。下面將對(duì)此過程作一描述。2.1.1熒光的產(chǎn)生室溫下，大多數(shù)分子處于基態(tài)的最低振動(dòng)能層。處于基態(tài)的分子吸收能量（電能、 熱能、化學(xué)能或光能等）后被激發(fā)為激發(fā)態(tài)。激發(fā)態(tài)不穩(wěn)定，將很快衰變?yōu)榛鶓B(tài)。下 面將主要從分子結(jié)構(gòu)理論來討論熒光產(chǎn)生機(jī)理。每個(gè)分子具有一

4、系列嚴(yán)格分立的能級(jí)，稱為電子能級(jí)，而每個(gè)電子能級(jí)中又包含 一系列振動(dòng)能層和轉(zhuǎn)動(dòng)能層，見圖2.1。圖中基態(tài)用S0表示，第一電子激發(fā)單重態(tài)和 第二電子激發(fā)單重態(tài)分別用S1和S2表示。T1為第一電子激發(fā)三重態(tài)。SINGLET EXITED STATETRIPLET EXITED STATEr r r rr r rVibrational relaxationInternal conversionIntersystem crossingS2 一S01入2X1入3SINGLET EXITED STATETRIPLET EXITED STATEr r r rr r rVibrational relaxati

5、onInternal conversionIntersystem crossingS2 一S01入2X1入3入4圖2.1熒光和磷光體系能級(jí)圖電子激發(fā)態(tài)的多重度用M=2s+1表示，s為電子自旋量子數(shù)的代數(shù)和，其數(shù)值 為0或1。根據(jù)Pauli不相容原理，分子中同一軌道所占據(jù)的兩個(gè)電子必須具有相反 的自旋方向，即自旋配對(duì)。假如分子中全部軌道里的電子都是自旋配對(duì)的，即s = 0, 分子的多重度M=1,該分子體系便處于單重態(tài)，用符號(hào)S表示。大多數(shù)有機(jī)分子的 基態(tài)是處于單重態(tài)的。分子吸收能量后，若分子在躍遷過程中不發(fā)生自旋方向的改變， 這時(shí)分子處于激發(fā)單重態(tài)，如圖2.1中的S1和S2。如果分子在躍遷過程中

6、還伴隨著自 旋方向的改變，這時(shí)分子便具有兩個(gè)自旋不配對(duì)的電子，即s=1，分子的多重度M =3,分子處于激發(fā)三重態(tài)，用符號(hào)T表示。處于分立軌道上的非成對(duì)電子，平行自 旋要比成對(duì)自旋更穩(wěn)定些(洪特規(guī)則)，因此三重態(tài)能級(jí)總是比相應(yīng)的單重態(tài)能級(jí)略 低，如圖2.1中的L。處在激發(fā)態(tài)的分子不穩(wěn)定，它可能通過輻射躍遷和非輻射躍遷等去活化過程返回 基態(tài)，其中以速度最快、激發(fā)態(tài)壽命最短的途徑占優(yōu)勢(shì)。有以下幾種基本的去活化過 程，振動(dòng)馳豫(Vibrational relaxation)；熒光發(fā)射；內(nèi)轉(zhuǎn)換(Internal conversion)； 外轉(zhuǎn)換(external conversion)；系間跨越(Int

7、ersystem crossing)；磷光發(fā)射(見 圖2.1)(王鎮(zhèn)浦等,1989;趙藻藩等,1990)。2.1.2熒光和分子結(jié)構(gòu)的關(guān)系分子產(chǎn)生熒光必須具備兩個(gè)條件：分子必須具有與所照射的輻射頻率相適應(yīng)的 結(jié)構(gòu)，才能夠吸收激發(fā)光；吸收了與其本身特征頻率相同的能量后，必須具有一定 的熒光量子產(chǎn)率。熒光量子產(chǎn)率(Q也稱熒光效率或量子產(chǎn)率，它表示物質(zhì)發(fā)射熒光的能力，通 常應(yīng)用下式表示：發(fā)射的光量子數(shù)Q = 一 .:一一一 吸收的光量子數(shù)許多吸光物質(zhì)并不能夠發(fā)射熒光，因?yàn)樵诩ぐl(fā)態(tài)分子釋放激發(fā)能的過程中除熒光發(fā)射 外，還有許多上述的輻射和非輻射躍遷過程與之競(jìng)爭(zhēng)。熒光量子產(chǎn)率與上述每一個(gè)過 程的速率常數(shù)有

8、關(guān)。用數(shù)學(xué)公式表示如下：kfk +E kf i式中kf為熒光發(fā)射過程的速率常數(shù)，k.為其他有關(guān)過程的速率常數(shù)的總和。從上式 可知，凡是能使kf值升高而使其他&值降低的因素，都能使熒光增強(qiáng)。一般而言，kf 值主要取決于化學(xué)結(jié)構(gòu)，而k.則主要取決于化學(xué)環(huán)境，同時(shí)也于化學(xué)結(jié)構(gòu)有關(guān)。躍遷類型:實(shí)驗(yàn)表明，大多數(shù)熒光物質(zhì)都是由兀兀*或者n 兀*躍遷激發(fā)，然后經(jīng)過振動(dòng) 馳豫或其他無輻射躍遷，再發(fā)生兀* T?；蜇? T n躍遷而產(chǎn)生熒光，其中兀* T兀躍遷 的量子效率較高。這是由于KTK *躍遷的摩爾吸光系數(shù)比n TK *躍遷的大100 1000倍，兀T兀*躍遷的壽命(10-710-9 S)比n T兀*躍遷的

9、壽命(10-510-7 S) 短，因此kf值較大；此外，兀* T兀躍遷過程中，通過系間跨越躍遷至三重態(tài)的速率 常數(shù)也較小，也有利于熒光的發(fā)射。共軛效應(yīng)含有KTK *躍遷能級(jí)的芳香族化合物的熒光最強(qiáng)。這種體系中的兀電子共軛程 度越大，則兀電子非定域性越大，越易被激發(fā)，熒光也就越易發(fā)生，而且熒光光譜將 向長(zhǎng)波移動(dòng)。任何有利于提高兀電子共軛度的結(jié)構(gòu)改變，都將提高熒光效率，并使熒 光波長(zhǎng)向長(zhǎng)波方向移動(dòng)。剛性平面結(jié)構(gòu)多數(shù)具有剛性平面結(jié)構(gòu)的有機(jī)分子具有強(qiáng)烈的熒光，因?yàn)檫@種結(jié)構(gòu)可以減少分子 的振動(dòng)，使分子與溶劑或其他溶質(zhì)分子的相互作用減小，即減小了碰撞去活化的可能 性。例如芴和聯(lián)苯在同樣條件下，其量子產(chǎn)率分

10、別為21和0.18,芴中的亞甲基使分 子的剛性增強(qiáng)，導(dǎo)致兩者在熒光性質(zhì)上的顯著差異。取代基效應(yīng)：芳香族化合物苯環(huán)上的不同取代基對(duì)該化合物的熒光強(qiáng)度和熒光光譜有顯著影 響。一般而言，給電子基團(tuán)，如一OH、一OR、一NH2、一CN、一NR2等，由于產(chǎn)生 了 p-K共軛作用，增強(qiáng)了兀電子共軛程度，使最低激發(fā)單重態(tài)與基態(tài)之間的躍遷幾 率增大，使熒光增強(qiáng)。而吸電子基團(tuán)如一COOH、一C = O、一NO?、一NO、鹵離子 等，會(huì)減弱甚至使熒光猝滅。此外，溶液中的溶解氧，由于順磁性的氧分子與處于激發(fā)單重態(tài)的熒光物質(zhì)分子 作用，促進(jìn)形成順磁性的三重態(tài)熒光分子，加速了系間跨越，從而導(dǎo)致產(chǎn)生了熒光猝 滅現(xiàn)象（趙藻

11、藩等,1990）。而一些順磁性金屬離子（如Cu、Hg、Zn等）也能夠使熒 光猝滅，可能與氧的猝滅作用類似。這一現(xiàn)象是利用熒光猝滅滴定技術(shù)研究有機(jī)質(zhì)與 金屬離子相互作用的基礎(chǔ)。2.2影響熒光強(qiáng)度的因素在談?wù)摕晒鈴?qiáng)度的影響因素之前，首先討論一下熒光強(qiáng)度與溶液濃度的關(guān)系。熒光強(qiáng)度if正比于吸收的光量ia與熒光量子產(chǎn)率中匕=中i又根據(jù)Beer定律I = 10 I = I o（1-10-&ic）Io和匕分別為入射和透射光強(qiáng)度。將此式代入上式得到I =甲/ （110-8lc ）=甲I （1 e-2.3lc ）式中8為摩爾吸光系數(shù)，l是樣品池光程，c為樣品濃度。而式中e-2.38ic = 1 2.38 lc

12、.2!3!當(dāng)8 lc 0.05時(shí)，可省略第二項(xiàng)之后各項(xiàng)，簡(jiǎn)化得到e-2.38lc =1 2.38 lc則有七=2.3 甲 108 lc當(dāng)入射光強(qiáng)度I與光程l 一定，得到If = Kc即熒光強(qiáng)度與熒光物質(zhì)的濃度成正比。但是，這種線性關(guān)系只有在極稀的溶液中，當(dāng) 8lc 0.05時(shí)才成立。對(duì)于較濃的溶液，由于熒光猝滅現(xiàn)象和自吸收等原因，使熒光 強(qiáng)度與濃度之間不呈線性關(guān)系。上述這種關(guān)系是應(yīng)用熒光光譜研究不同來源溶解有機(jī)質(zhì)的DOC含量與熒光光譜 強(qiáng)度之間關(guān)系的理論基礎(chǔ)。下面就影響熒光強(qiáng)度的一些因素作一小結(jié)。2.2.1溶劑對(duì)熒光強(qiáng)度的影響溶劑的影響可分為一般溶劑效應(yīng)和特殊溶劑效應(yīng)，前者指的是溶劑的折射率和

13、介 電常數(shù)的影響；后者指的是熒光體和溶劑分子間的特殊化學(xué)作用，如氫鍵的生成和化 合作用。一般溶劑效應(yīng)是普遍的，而特殊溶劑效應(yīng)則取決于溶劑和熒光體之間的化學(xué) 結(jié)構(gòu)。特殊溶劑效應(yīng)所引起熒光光譜的移動(dòng)值，往往大于一般溶劑效應(yīng)所引起的影響。 由于溶質(zhì)分子與溶劑分子之間的作用，使同一種熒光物質(zhì)在不同溶劑中的熒光光譜可 能會(huì)有顯著差異。如果溶劑和熒光物質(zhì)形成了化合物，或者溶劑使熒光物質(zhì)的電離狀態(tài)發(fā)生改變， 則熒光峰位置和強(qiáng)度都會(huì)發(fā)生較大改變。2.2.2溫度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響溫度對(duì)熒光強(qiáng)度的影響比較敏感，因此熒光分析時(shí)一定要控制好溫度。溫度上升 使熒光強(qiáng)度下降，其中一個(gè)主要原因是分子的內(nèi)部能量轉(zhuǎn)化作用。當(dāng)激發(fā)

14、分子接受額 外熱能時(shí)，有可能使激發(fā)能轉(zhuǎn)化為基態(tài)的振動(dòng)能，隨后迅速振動(dòng)馳豫而喪失振動(dòng)能量。 另外一個(gè)原因是溶液溫度下降時(shí)，介質(zhì)粘度增大，熒光物質(zhì)與溶劑分子的碰撞也隨之 減少。相反，隨著溫度上升，碰撞頻率增加，使外轉(zhuǎn)換的去活化幾率增加。由于熒光物質(zhì)在低溫下熒光強(qiáng)度比在室溫下有顯著增強(qiáng)，為了提高靈敏度，近年 來低溫?zé)晒夥治鲆寻l(fā)展成為熒光分析中的一個(gè)重要分支。2.2.3溶液pH值對(duì)熒光強(qiáng)度的影響帶有酸性或堿性基團(tuán)的多數(shù)芳香族化合物的熒光一般都與溶液的pH有關(guān)。因此 在熒光分析中要嚴(yán)格控制溶液pH值。2.2.4內(nèi)濾光作用和自吸收現(xiàn)象溶液中若存在著能夠吸收激發(fā)或熒光物質(zhì)所發(fā)射光能的物質(zhì)，就會(huì)使熒光減弱，

15、這種現(xiàn)象稱為“熒光內(nèi)濾作用(Inner filtering effect)”。例如，在1 cm-3的色氨 酸溶液中，如果存在 K Cr 0 ,由于在色氨酸的激發(fā)和發(fā)射峰附近正好是K Cr O 的 ，乙Z-i /乙Z-i /兩個(gè)吸收峰，吸收了色氨酸的激發(fā)能和色氨酸發(fā)射的熒光，使測(cè)得的色氨酸熒光大大 降低。內(nèi)濾光作用的另外一種情況是熒光發(fā)射光譜的短波長(zhǎng)一端與該物質(zhì)的吸收光譜 的長(zhǎng)波長(zhǎng)一端有重疊。在溶液濃度較大時(shí)，一部分熒光發(fā)射被自身吸收，產(chǎn)生所謂的 “自吸收”現(xiàn)象而降低了溶液的熒光強(qiáng)度(王鎮(zhèn)浦等,1989;趙藻藩等,1990)。2.3熒光光譜實(shí)驗(yàn)技術(shù)2.3.1時(shí)間分辨技術(shù)時(shí)間分辨發(fā)光光譜技術(shù)是基于

16、不同發(fā)光體的發(fā)光衰減速率的不同，配置使用帶時(shí) 間延遲設(shè)備的脈沖光源（閃光燈或激光器）和帶有門控時(shí)間電路的檢測(cè)器件，通過選 定延遲時(shí)間4和門控時(shí)間，對(duì)發(fā)射單色器進(jìn)行掃描，得到時(shí)間分辨發(fā)射光譜，從而 實(shí)現(xiàn)對(duì)光譜重疊但是發(fā)光壽命不同的組分進(jìn)行分辨和分別測(cè)定?；蛘吖潭ぐl(fā)與發(fā)射 波長(zhǎng)，對(duì)門控時(shí)間掃描，得到發(fā)光強(qiáng)度隨時(shí)間的衰減曲線，從而實(shí)現(xiàn)發(fā)光壽命的測(cè)量。 時(shí)間分辨技術(shù)還能夠利用不同發(fā)光體形成速率的不同進(jìn)行選擇性測(cè)定（陳培榕等， 1999）。由于熒光壽命相比磷光壽命要短得多，所以磷光更有利于時(shí)間分辨技術(shù)的實(shí)施。 本論文由于只涉及到天然水體中溶解有機(jī)質(zhì)的熒光光譜特征，所以未使用時(shí)間分辨技 術(shù)對(duì)DOM進(jìn)行研

17、究。2.3.2偏振和各向異性在偏振光激發(fā)下，熒光體所發(fā)射的熒光在空間不同取向其強(qiáng)度不同，即偏振光。 熒光偏振和各向異性測(cè)定只需要在熒光光譜分析儀的激發(fā)和發(fā)射光路上分別加上起 偏器和檢偏器（統(tǒng)稱偏振附件）。分子熒光的偏振現(xiàn)象最初由Perrin在1926年發(fā)現(xiàn)，后來他用此方法研究溶液中 分子的運(yùn)動(dòng)及其構(gòu)型變化。熒光偏振就是用平面偏振光去探測(cè)溶液中分子旋轉(zhuǎn)的速率 變化。只有在電子的遷移力距平行于入射偏振光的平面時(shí)，入射偏振光才能被分子所 吸收。吸收了偏振光的分子在返回基態(tài)時(shí)就發(fā)射以電子的遷移力距相平行的偏振光。 但是，如果分子在溶液中旋轉(zhuǎn)，那么該偏振光將會(huì)由于電子遷移力距方位的變化而發(fā) 生去偏振現(xiàn)象

18、（depolarization，即偏振值降低）。因此，分子發(fā)射的偏振光可與溶液中 分子旋轉(zhuǎn)的速率相對(duì)應(yīng)。而溶液中分子旋轉(zhuǎn)的速率又與分子的幾何結(jié)構(gòu)有關(guān)，因?yàn)榉?子的形狀決定了分子旋轉(zhuǎn)時(shí)的磨擦阻力的大小。所以，使用熒光偏振就可通過觀察與 有機(jī)大分子絡(luò)合的配位體濃度改變時(shí)有機(jī)大分子發(fā)射的偏振光的變化，從而推斷出有 機(jī)大分子的構(gòu)形變化。偏振值P的定義由下式給出：p= （I Li |） / （I +i |）I 和I |為熒光儀或分光光度計(jì)的發(fā)射偏振器（emission polarizer）的方位平行 和垂直于激發(fā)偏振光而得到的熒光強(qiáng)度。由于偏振光的熒光測(cè)量不受光源強(qiáng)度波動(dòng)的 影響，因而精度非常高。發(fā)生熒

19、光去偏振作用的外部因素有兩個(gè)：一、通過電子的能 量轉(zhuǎn)換導(dǎo)致的激發(fā)態(tài)遷移；二、處于激發(fā)態(tài)時(shí)分子旋轉(zhuǎn)造成的遷移力距方位的變化。在運(yùn)用熒光偏振方法時(shí)，我們經(jīng)常用到r(Anisotropy)值，它是在熒光偏振研究 中為了計(jì)算方便而假定的一種表達(dá)熒光偏振值的方式。Anisotropy值(r)的定義為：(r) = (I -I |) / (I + 2I |)2.3.3同步熒光掃描技術(shù)根據(jù)激發(fā)和發(fā)射單色器在掃描過程中彼此間所保持的關(guān)系，同步掃描技術(shù)可以分 為固定波長(zhǎng)差、固定能量差以及可變角(可變波長(zhǎng))同步掃描。同步掃描技術(shù)具有使 光譜簡(jiǎn)化、譜帶窄化、提高分辨率、減少光譜重疊、提高選擇性和減少散射光影響等 優(yōu)點(diǎn)

20、。固定波長(zhǎng)差同步熒光光譜中，波長(zhǎng)差的選擇直接影響到同步熒光光譜的形狀、帶 寬和信號(hào)強(qiáng)度，從而提供了一種提高選擇性的途徑。例如，酪氨酸(Tyrosine)和色 氨酸(Tryptophan)的熒光激發(fā)光譜很相似，發(fā)射光譜又嚴(yán)重重疊，但是AA60 nm的同步熒光光譜只顯示色氨酸 的光譜特征，從而可實(shí)現(xiàn)分別測(cè)定。目前，有關(guān)合適&的選擇已有若干理論研究， 但是在實(shí)際應(yīng)用中大多根據(jù)具體體系通過實(shí)驗(yàn)加以選擇。在可能條件下，選擇等于 Stokes位移的A值是有利的，有可能獲得熒光信號(hào)最強(qiáng)、半峰寬最小的同步熒光光 譜。固定能量差(Av)同步掃描可克服0-0帶躍遷非常弱甚至不顯示的情況下，以 及不同組分對(duì)位的不同

21、要求所帶來的困難。有可能對(duì)同一類化合物(如多環(huán)芳烴) 只選擇一個(gè)Av值用于整個(gè)光譜的掃描，同時(shí)還能最大限度地減小瑞利散射(Raleigh Scattering)和拉曼散射(Raman Scattering)的干擾(陳培榕等,1999)。可變角同步掃描技術(shù)可進(jìn)一步提高測(cè)量的選擇性，由于在本論文中未涉及此項(xiàng)技 術(shù)，在此不在贅述。2.3.4三維熒光光譜三 維熒 光光譜（Three-dimensional excitation emission matrix fluorescence spectroscopy, 3DEEM）,也可稱為總發(fā)光光譜或激發(fā)一發(fā)射矩陣圖，與常規(guī)熒光光譜 技術(shù)的主要區(qū)別是能夠普獲得激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)同時(shí)變化時(shí)的熒光強(qiáng)度信息。三維 熒光光譜有兩種表示形式：等（強(qiáng)度）高線圖Contour plot）和等角三維投影圖（3D plot or surface plot）。等高線圖易于獲得更多的信息，能體現(xiàn)與常規(guī)熒光光譜、同步熒 光光譜的關(guān)系（如圖2.2所示）。三維熒光光譜能夠獲得完整的光譜信