芽孢桿菌發(fā)酵中藥復(fù)方及抑菌活性的檢測(cè)

1、芽抱桿菌發(fā)酵中藥復(fù)方及抑菌活性的檢測(cè) 中草藥飼料添加劑屬于天然藥物，大量實(shí)驗(yàn)研 究表明，中草藥飼料添加劑具有促進(jìn)動(dòng)物生長(zhǎng)發(fā) 育（李宗輝等，2002）、提高飼料轉(zhuǎn)化率、改善畜禽產(chǎn) 品質(zhì)量（李洪龍等，2007；劉根新等，2007）、增強(qiáng)動(dòng) 物免疫功能等作用（王麗輝等，2007），其研究和應(yīng) 用已受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的普遍關(guān)注。隨著對(duì)中藥制劑 的深入研究，微生物發(fā)酵中藥成為一種新的中藥炮 制方法。微生物具有非常豐富的酶系統(tǒng)，具有強(qiáng)大 的分解、轉(zhuǎn)化物質(zhì)的能力，通過(guò)微生物的降解作用， 中藥的有效成分和活性物質(zhì)被最大限度的釋放出 來(lái)。另外，微生物發(fā)酵中藥的過(guò)程中，中藥的一些成 分可能誘導(dǎo)微生物的某些代謝途徑發(fā)生

2、變化，從而 產(chǎn)生新的活性物質(zhì)（韓春楊等，2005）。科寶天然植物草粉主要成分為脫毒紫莖澤蘭草粉，目前已經(jīng)作為飼料添加劑大量應(yīng)用于畜牧生 產(chǎn)，具有提高生產(chǎn)性能、抑菌及抗病毒的作用。紫錐 菊具有顯著的免疫增強(qiáng)和抗病毒作用，是國(guó)際上研 究比較熱門(mén)的免疫調(diào)節(jié)劑（肖培根，1996）。中藥板 藍(lán)根具有清熱、解毒之功效。實(shí)驗(yàn)中選用公司菌種 保藏中心保存的三株性能較好的芽抱桿菌，芽抱菌 7348、Zfy4、地衣芽抱菌對(duì)植物草粉、板藍(lán)根、紫錐 菊的不同組方進(jìn)行發(fā)酵，并檢測(cè)了發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)大腸 桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌的抑菌作用，篩選 最佳發(fā)酵菌株及中藥組方，旨在為研發(fā)出新型抗 菌、抗病毒產(chǎn)品提供理論依據(jù)。1材

3、料和方法1.1材料菌株：芽抱菌7348、Zfy4、地衣芽抱菌由山東寶 來(lái)利來(lái)生物研究院菌種保藏中心保存；指示菌：大 腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌由山東寶來(lái)利 來(lái)生物研究院菌種保藏中心保存。中藥：科寶天然植物草粉由昆明科寶飼料有限公司提供；板藍(lán)根購(gòu)買(mǎi)自永春堂藥店；紫錐菊由陜西嘉禾藥業(yè)提供。1.2方法1.2.1復(fù)方中藥分組，見(jiàn)表1。1.2.2中藥發(fā)酵摘要本文開(kāi)展了芽抱桿菌7348、Zfy4、地衣芽抱菌對(duì)植物草粉、板藍(lán)根、紫 錐菊的不同組方進(jìn)行發(fā)酵，并檢測(cè)了發(fā)酵產(chǎn)物對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌的生長(zhǎng)抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：芽抱 菌7348發(fā)酵中藥復(fù)方2和復(fù)方5，發(fā)酵后芽抱菌活菌數(shù)最高，且

4、對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、金黃色葡萄球菌具有顯著地抑菌作用。研究結(jié)果表明芽抱菌發(fā)酵中藥的過(guò)程中，微生物與中草藥的相互作用，使中藥復(fù)方的有效成分被釋放出來(lái)，從而增強(qiáng)了中藥 復(fù)方的抗菌活性。關(guān)鍵詞芽孢桿菌；發(fā)酵；中藥復(fù)方；抑菌活性中藥復(fù)方植物草粉：板藍(lán)根：紫錐菊組方1 5： 1 ： 4組方2 5： 2 ： 3組方 3 5 ： 1 ： :1組方 4 5：3：2組方 5 5：4：1表1復(fù)方中藥分組-24 -表3中藥復(fù)方發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌的抑制作用中藥復(fù)方/菌株未發(fā)酵7348地衣芽孢菌Zfy4大腸桿菌 沙門(mén)氏菌 大腸桿菌 沙門(mén)氏菌 大腸桿菌 沙門(mén)氏菌 大腸桿菌 沙門(mén)氏菌培養(yǎng)基組方1低敏中敏組方2低敏

5、低敏中敏高敏低敏中敏組方3低敏低敏中敏高敏組方4組方5低敏低敏高敏高敏低敏低敏注：抑菌圈直徑大于20mm為極敏，抑菌圈直徑1520mm為高敏，抑菌圈直徑為1015mm為中敏，抑菌圈直徑小于10mm為低敏，無(wú)抑菌圈的為不敏感，用“-”表示。表2芽抱菌菌株生長(zhǎng)的影響(CPUX108)中藥復(fù)方/菌株7348地衣芽孢菌Zfy4芽抱培養(yǎng)基2.04 2.85 2.1組方 1 12.0 0.001 12.6組方 2 11.0 0.0015 14.8組方 3 13.8 0.001 9.3組方 4 7.2 0.002 14.9組方 5 15.8 0.0015 11.3廣東飼料第22卷第11期2013年11月試驗(yàn)

6、研究將中藥磨粉后，按照組方比例混勻稱(chēng)取8g于250mL的三角瓶中，加入80mL純凈水，121C滅菌30min，每瓶按照4%濃度接入芽抱桿菌菌液，37C、轉(zhuǎn)速180/min搖床培養(yǎng)30h，并設(shè)未發(fā)酵中藥、芽孢菌菌液為對(duì)照。1.2.3平板計(jì)數(shù)法檢測(cè)活菌數(shù)發(fā)酵30h后，終止發(fā)酵，每瓶取1mL發(fā)酵液于含9mL的生理鹽水的試管中，充分震蕩均勻后取 1ml于下一個(gè)試管中，以此倍比稀釋到所要的稀釋 度（本實(shí)驗(yàn)取10 -5、10-6、10-7、108個(gè)稀釋度），將每個(gè)稀釋度取1mL滴在滅菌平板上，兩個(gè)重復(fù)，然后加 入50C芽抱培養(yǎng)基，搖勻，37C培養(yǎng)24h，進(jìn)行菌落 計(jì)數(shù)。1.2.4體外抑菌實(shí)驗(yàn)（牛津杯法）吸

7、取15mLLB （1.5%的瓊脂）培養(yǎng)基倒入滅菌培 養(yǎng)皿中，使其在平皿的底部均勻分布、凝固，作為底 層，吸取指示菌液適量加入下層已凝固的平皿中， 同時(shí)加入5mL，50C上層LB （0.8%瓊脂粉）培養(yǎng)基 中，充分搖勻，作為菌層。在每個(gè)平板上放置已滅菌 的牛津杯（直徑為8mm） 5個(gè)，稍微下壓，使其與平 板培養(yǎng)基無(wú)縫隙。發(fā)酵液進(jìn)行離心，取上清液280 “L 加入到牛津杯中，靜置510min，放入37C培養(yǎng)箱 中過(guò)夜，次日測(cè)量抑菌圈大小并記錄。抑菌圈直徑大 于20mm為極敏，抑菌圈直徑1520mm為高敏， 抑菌圈直徑為1015mm為中敏，抑菌圈直徑小于 10mm為低敏，無(wú)抑菌圈的為不敏感（朱力軍，

8、2001）。 2結(jié)果與分析2.1芽抱菌發(fā)酵中藥復(fù)方中芽抱菌生長(zhǎng)的影響 芽抱菌發(fā)酵中藥復(fù)方平板計(jì)數(shù)結(jié)果見(jiàn)表2， 實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)芽抱菌7348、地衣、Zfy4在芽抱培養(yǎng)基 生長(zhǎng)30h之后芽抱菌數(shù)在2X10 8左右，與培養(yǎng)基相比，芽抱菌7348、Zfy4發(fā)酵中藥復(fù)方30h之后活 菌數(shù)達(dá)到109左右，表明芽抱菌7348、Zfy4可以用于發(fā)酵中藥復(fù)方；地衣芽抱桿菌發(fā)酵中藥復(fù)方 30h后活菌數(shù)僅10 5，表明地衣芽抱菌不適合發(fā)酵 中藥復(fù)方。2.2芽孢菌發(fā)酵中藥復(fù)方上清液對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌抑制作用芽抱菌發(fā)酵中藥復(fù)方發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表3,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)芽抱菌液對(duì)大 腸桿菌、沙門(mén)氏菌沒(méi)有抑制作用，

9、未發(fā)酵的中藥復(fù) 方對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌有弱的或無(wú)抑菌作用；與 菌液及未發(fā)酵中藥復(fù)方相比，芽抱菌7348發(fā)酵中 藥復(fù)方后對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌具有抑制作用，特 別是發(fā)酵中藥組方2、3、5對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌具 有顯著地抑制作用。與芽抱菌菌液及未發(fā)酵中藥復(fù) 方相比，地衣芽抱菌、Zfy4發(fā)酵后上清液對(duì)大腸桿 菌、沙門(mén)氏菌的抑菌活性不變或降低。-25 -表4中藥復(fù)方發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用 中藥復(fù)方/菌株未發(fā)酵7348地衣芽孢菌Zfy4 芽抱培養(yǎng)基中敏中敏中敏 組方1低敏極敏極敏- 組方2低敏極敏-中敏 組方3低敏高敏中敏- 組方4低敏高敏低敏高敏 組方 5 低敏 極敏 中敏 中敏注：抑菌圈直徑

10、大于20mm為極敏，抑菌圈直徑1520mm為 高敏，抑菌圈直徑為1015為中敏，抑菌圈直徑小于10mm為低 敏，無(wú)抑菌圈的為不敏感，用“-”表示。廣東飼料第22卷第11期2013年11月試驗(yàn)研究2.3芽抱菌發(fā)酵中藥上清液對(duì)金黃色葡萄球菌 的抑制作用芽抱菌發(fā)酵中藥復(fù)方發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表4,實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)芽抱菌7348、地 衣、Zfy4菌液及未發(fā)酵中藥復(fù)方對(duì)金黃色葡萄球菌 均有一定的抑制作用；與7348菌液及未發(fā)酵中藥 復(fù)方相比，芽抱菌7348發(fā)酵中藥復(fù)方后對(duì)金黃色 葡萄球菌具有顯著的抑制作用，特別是中藥組方 1、2、5 發(fā)酵后對(duì)金黃色葡萄球菌具有極顯著的抑 制作用；與芽抱菌菌液及未

11、發(fā)酵中藥復(fù)方相比，地 衣芽抱菌、Zfy4發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作 用沒(méi)有顯著性。3討論利用益生菌發(fā)酵中藥是近年來(lái)研究的新領(lǐng)域，國(guó)內(nèi)已發(fā)表多篇以乳酸菌、芽抱菌、酵母菌發(fā)酵中 藥的報(bào)道。研究表明，微生物具有非常豐富的酶系 統(tǒng)，具有強(qiáng)大的分解、轉(zhuǎn)化物質(zhì)的能力，包括氧化、 酯化、甲基化、還原化等多種功能，中草藥被發(fā)酵 后，中藥的有效成分和活性物質(zhì)被最大限度的釋放 出來(lái)，同時(shí)還可以產(chǎn)生新的活性物質(zhì)。微生物發(fā)酵 中藥之后，不僅可以改變一些中藥的藥性、提高療效、降低毒副作用，而且微生物的生長(zhǎng)繁殖對(duì)機(jī)體 自身也具有有益的作用（王興紅等，2001）。芽孢桿 菌具有繁殖力強(qiáng)，營(yíng)養(yǎng)要求低，對(duì)環(huán)境的適應(yīng)性好，

12、耐酸堿等特性。大量研究表明，芽抱桿菌屬于細(xì)菌 如蠟樣芽抱桿菌、枯草芽抱桿菌等對(duì)維持機(jī)體消化 道正常菌群平衡、抑制病原菌繁殖、提高飼料轉(zhuǎn)化 率具有顯著地作用。已有研究證實(shí)，芽抱桿菌對(duì)50 種中藥的發(fā)酵液具有不同的抑菌活力，表明芽抱桿 菌的性質(zhì)及不同中藥的組分對(duì)發(fā)酵作用具有不同 的影響（李國(guó)紅等，2006）。本實(shí)驗(yàn)選用的實(shí)驗(yàn)室性 能良好的、生產(chǎn)常用的3株芽孢桿菌對(duì)金黃色葡萄 球菌具有一定的抑制作用，對(duì)維持消化道正常菌群 的平衡具有一定的作用?？茖毺烊恢参锊莘壑饕煞譃槊摱咀锨o澤蘭 草粉，目前已經(jīng)作為飼料添加劑大量應(yīng)用于畜牧生 產(chǎn)，具有提高生產(chǎn)性能，抑菌及抗病毒的作用，并且 在我國(guó)具有豐富的資源。紫

13、錐菊具有突出的抗感染 及促免疫作用，是目前受到國(guó)際重視的一種免疫促 進(jìn)劑和免疫調(diào)節(jié)劑。板藍(lán)根具有清熱解毒、涼血利 咽之功效（孟紅梅等，2006），因其具有較強(qiáng)的抗菌 抗病毒和抗內(nèi)毒素的作用（陳慶，2009），而被廣泛 應(yīng)用。本研究基于天然植物草粉、紫錐菊、板藍(lán)根的 藥理學(xué)作用進(jìn)行中藥組方。本研究利用芽抱桿菌對(duì)天然植物草粉、紫錐 菊、板藍(lán)根的不同組方進(jìn)行發(fā)酵，并對(duì)其發(fā)酵液抑 菌活性的檢測(cè)。結(jié)果表明：芽抱菌7348、Zfy4在中 藥復(fù)方中均能生長(zhǎng)，說(shuō)明中藥能提供芽抱菌生長(zhǎng) 所必需的營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)，而地衣芽抱菌在中藥復(fù)方中 不能繁殖。抑菌實(shí)驗(yàn)表明，芽抱菌7348發(fā)酵中藥 組方2和組方5,其發(fā)酵上清液對(duì)大腸桿菌、沙門(mén) 氏菌、金黃色葡萄球菌具有顯著的抑菌作用；然而 Zfy4發(fā)酵中藥組方上清液對(duì)大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、 金黃色葡萄球菌的抑制作用不變或降低。部分中 藥組方發(fā)酵產(chǎn)物抑菌活性增加，表明芽抱菌促進(jìn) 中藥釋放更多的抑菌活性成分，且芽抱菌利用自 身酶系統(tǒng)產(chǎn)生了新的具有抗菌活性的物質(zhì)，或者 微生物自身的代謝產(chǎn)物與中藥具有協(xié)調(diào)抗菌活 性。另外有些發(fā)酵后抑菌活性不變或降低原因可 能由于芽抱菌將中藥中的一些抑菌活性物質(zhì)轉(zhuǎn)化 為無(wú)活性的