分子生物學(xué)與生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)操作設(shè)計(jì)與技能(7-2)課件

1、分子生物學(xué)與生物化學(xué)實(shí)驗(yàn)操作、設(shè)計(jì)與技能 幾種重要的PCR技術(shù)(一) 李剛 副教授幾種重要的PCR技術(shù)差異顯示PCR3RTPCR；1出錯(cuò)PCR（致突變PCR）45RACE和3RACE PCR；2OEPCR5RT-PCR概述（1）RT- PCR（Reverse Transcription-Polymerase Chain Reaction）即逆轉(zhuǎn)錄PCR，是將RNA的逆轉(zhuǎn)錄（RT）和cDNA的聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增反應(yīng)（PCR）相結(jié)合的技術(shù)。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細(xì)胞/組織中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。RT-PCR概述（2）首先經(jīng)反轉(zhuǎn)錄酶

2、的作用從RNA合成 cDNA，再以cDNA為模板，擴(kuò)增合成目的片段。RT-PCR技術(shù)靈敏而且用途廣泛，可用于檢測細(xì)胞中基因表達(dá)水平，細(xì)胞中RNA病毒的含量和直接克隆 特定基因的cDNA序列。作為模板的RNA可以是總RNA、mRNA或體外轉(zhuǎn)錄的RNA產(chǎn)物。無論使用何種RNA，關(guān)鍵是確保RNA中無RNA酶和基因組 DNA的污染。用于反轉(zhuǎn)錄的引物可視實(shí)驗(yàn)的具體情況選擇隨機(jī)引物、Oligo dT 及基因特異性引物中的一種。對于短的不具有發(fā)卡結(jié)構(gòu)的真核細(xì)胞mRNA，三種都可。常見的三種反轉(zhuǎn)錄酶特性1、鳥類成髓細(xì)胞瘤病毒（AMV）與鼠白血病病毒勒尼株（MoMLV）來源的中溫酶。AMV來源的反轉(zhuǎn)錄酶具有高活

3、性的RNase H,這種高活性RNase H趨向于抑制cDNA的產(chǎn)生限制其合成長度。MoMLV來源的反轉(zhuǎn)錄酶更適合RTPCR，因?yàn)樗腞Nase H活性較弱。但它催化反應(yīng)的最適溫度為37度，較AMV反轉(zhuǎn)錄酶的42度為低，因而對于具有高度二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA模板可能會(huì)帶來稍微不利的影響。2、缺乏RNase H活性的MoMLV反轉(zhuǎn)錄酶的突變體。這些酶較野生型酶對模板RNA分子的轉(zhuǎn)錄效率更高，合成cDNA分子的長度更長。此外，還能在更高溫度下合成cDNA（高達(dá)50度），這對于容易折疊成二級(jí)結(jié)構(gòu)的RNA模板更為有利。3、嗜熱熱穩(wěn)定Tth DNA聚合酶，這種酶在RTPCR中的主要優(yōu)點(diǎn)：它能在反轉(zhuǎn)錄與擴(kuò)增兩個(gè)

4、階段均起作用，實(shí)驗(yàn)在同一個(gè)反應(yīng)管內(nèi)進(jìn)行。但這種酶功不抵過，一方面這種酶合成的cDNA平均長度僅為12kb,它短于MoMLV反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA長度（約10kb）；此外，Mn2的存在會(huì)造成DNA合成的低保真度也是令人擔(dān)心的地方。最后，該酶不能用Oligo(dT)或隨機(jī)六核苷酸作為引物，因?yàn)樗拇呋磻?yīng)的最適溫度下這兩種引物不能與RNA模板形成穩(wěn)定的雜合體。RTPCR的原理RT-PCR是一種從細(xì)胞RNA（mRNA）中高效靈敏地?cái)U(kuò)增cDNA序列的方法，它由兩大步驟組成：一步是反轉(zhuǎn)錄（RT），另一步是PCR。反轉(zhuǎn)錄的起始材料可以用總RNA，也可以用mRNA。 首先，在反轉(zhuǎn)錄酶作用下將RNA（mRNA）

5、反轉(zhuǎn)錄成cDNA第一鏈，即以oligo(dT)、隨機(jī)六寡核苷酸或基因特異序列為引物與mRNA雜交，然后由RNA依賴的DNA聚合酶（反轉(zhuǎn)錄酶）催化合成相應(yīng)互補(bǔ)的cDNA鏈。以該cDNA第一鏈為模板，即可進(jìn)行PCR擴(kuò)增。根據(jù)靶基因設(shè)計(jì)用于PCR擴(kuò)增的基因特異的上下游引物，基因特異的上游引物與cDNA第一鏈退火，在Taq DNA聚合酶作用下合成cDNA第二鏈。再以cDNA第一鏈和第二鏈為模板，用基因特異的上下游引物PCR擴(kuò)增獲得大量的cDNA。 RT-PCR原理示意圖 一步法和兩步法的比較一步法與兩步法的最大區(qū)別在于RT和PCR在同一個(gè)管子中進(jìn)行。與兩步法相比，一步擴(kuò)增法不僅簡單、有效，簡化了整個(gè)R

6、T-PCR的步驟，并且最大程度上避免了樣品的污染。此外，一步法在檢測低豐度mRNA的表達(dá)時(shí)比常規(guī)RT-PCR更具優(yōu)勢，一步RT-PCR法可從少至10pg總RNA中檢測出基因的表達(dá)。但當(dāng)分析很多基因在少量不同RNA樣品表達(dá)時(shí)，兩步法也不失為一種較好的方法。此外，在避免樣品污染的情況下，兩步法的擴(kuò)增效果經(jīng)常要比一步法好。 一步法操作步驟（1）（以TaKaRa公司TaKaRa One Step RNA PCR Kit為例）1、按下列組成配制RTPCR反應(yīng)液。10One step RNA PCR buffer 5lMgCl2 (25 mM) 10 ldNTP Mixture (各10mM) 5 lRN

7、ase inhibitor (40 U/ l) 1 lAMV RTase XL (5 U/ l) 1 lAMV-optimized Taq (5 U/ l) 1 l上游特異性引物（20 M） 1 l下游特異性引物（20 M） 1 lPositive Control RNA或?qū)嶒?yàn)樣品（1 g total RNA）* 1 lRNase Free dH2O 24 lTotal 50 l/sample*當(dāng)目的RNA的表達(dá)量較少時(shí)，可加至25 ，同時(shí)在反應(yīng)體系中相應(yīng)地減少水的量。一步法操作步驟（2）（以TaKaRa公司TaKaRa One Step RNA PCR Kit為例）按以下條件進(jìn)行RTPCR反

8、應(yīng)：50 C 30 min RT反應(yīng)94 C 2 min RTase失活94 C 30 sec37-65 C 30 sec PCR反應(yīng)2530cycles72 C 1-10 min兩步法操作步驟（1）（以TaKaRa公司TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver. 3.0為例）A 反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)合成cDNA引物可結(jié)合實(shí)際情況從Oligo dT、隨機(jī)性引物或特異性引物中任選一種。1、按下列組成配制反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液。10 RNA PCR buffer 1lMgCl2 (25mM) 2 ldNTP Mixture (各10mM) 1 lRNase inhibitor (40 U/ l) 0.5 l

9、AMV Reverse transcriptase 1 l下游特異性引物（20 M） 0.5 lPositive Control RNA或?qū)嶒?yàn)樣品（500 ng total RNA） 1 lRNase Free dH2O 3.75 lTotal 10 l/sanple此反應(yīng)體系已添加足夠dNTP,PCR反應(yīng)時(shí)不需要再添加dNTP。兩步法操作步驟（2）（以TaKaRa公司TaKaRa RNA PCR Kit（AMV）Ver. 3.0為例）按以下條件進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)：4255C 1530 min RT反應(yīng)99C 5 min RTase失活5 C 5 minRTPCR產(chǎn)品推薦1、TaKaRa公司系列產(chǎn)

10、品；2、Promega公司系列產(chǎn)品；RT-PCR操作視頻RNA提取和RT-PCR實(shí)驗(yàn).flvRT-PCR的幾點(diǎn)注意事項(xiàng)RT-PCR實(shí)驗(yàn)有三步：抽提RNA，RT，PCR。要求：1.做RT前必需測RNA濃度，逆轉(zhuǎn)錄體系對RNA量還是有一些要求，常用500ng或1ug。2. RT按要求做，一般不會(huì)出太大問題。 3. PCR，按常規(guī)。但如需擴(kuò)長片段，則對前兩步要求較高，需要有完整的cDNA存在，不是單改變Mg2+濃度、退火溫度能解決的。一步RT-PCR和兩步RT-PCR方法哪個(gè)更好？一步RT-PCR的最大優(yōu)點(diǎn)是操作簡單，因此可避免樣品間的交叉污染。但我們的實(shí)踐經(jīng)驗(yàn)表明，在大多數(shù)情況下，應(yīng)首先考慮兩步R

11、T-PCR方，而不是一步RT-PCR，因?yàn)閮刹絉T-PCR產(chǎn)物的產(chǎn)量一般高于一步RT-PCR；此外兩步法具有更大的靈活性，可以分別優(yōu)化RT和PCR兩步反應(yīng)，而無需考慮它們之間的干擾。RT-PCR的引物設(shè)計(jì)1）RT-PCR時(shí)的引物設(shè)計(jì)是不是一定要先知道目的基因的序列?答：必須知道。在RT時(shí)，引物設(shè)計(jì)有3種方法即a：Random 9mers；b：Oligo dT-Adaptor Primer；和c：特異的下游引物。如果用a和b方法，是擴(kuò)增的所有的cDNA（理論上），還要用此產(chǎn)物做PCR 的模板繼續(xù)擴(kuò)增。如果用c方法，那么要去那里查它的序列呢？RT-PCR以總DNA作為模板還是以mRNA作為模板好？

12、提取總RNA還是mRNA取決于實(shí)驗(yàn)?zāi)康摹Ｒ话闱闆r下（如克隆基因或比較不同樣品間基因表達(dá)水平時(shí)），提取總RNA即可作為RT-PCR的模板。這樣可以減少獲得cDNA的實(shí)驗(yàn)步驟，從而減少實(shí)驗(yàn)誤差。另外，分離總RNA要比分離mRNA少用一些試劑，因此更經(jīng)濟(jì)。但是若要構(gòu)建cDNA文庫，則需要分離mRNA作為模板，以便提高cDNA文庫的質(zhì)量。如何防止提取RNA過程中RNA的降解？主要注意以下幾點(diǎn)：實(shí)驗(yàn)過程中使用的玻璃器皿使用前可于180 C干烤8小時(shí)以上，塑料制品要用氯仿沖洗。焦磷酸二乙酯（DEPC）是RNase酶的強(qiáng)烈抑制劑，RNA提取過程和反轉(zhuǎn)錄過程中所用的水要用DEPC處理。操作人員的手是RNase

13、的重要污染源，進(jìn)行RNA實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)始終戴手套，并應(yīng)勤換手套。提取的樣品材料應(yīng)盡可能新鮮，如果不能及時(shí)提取RNA，取樣后應(yīng)保存于液氮中。如何選擇反轉(zhuǎn)錄引物？（1）兩步法中反轉(zhuǎn)錄引物有oligo(dT)(12-18個(gè)核苷酸組成)、隨機(jī)六聚寡核苷酸和基因特異引物，可根據(jù)不同的目的選擇不同的引物。Oligo(dT)引物能與哺乳動(dòng)物mRNA的3端poly(A)尾巴互補(bǔ)，作為一種通用引物用于cDNA第一鏈的合成。隨機(jī)六聚寡核苷酸引物能與RNA模板的許多位點(diǎn)互補(bǔ)，因此，當(dāng)RNA序列很長（3kb）或其中包含很多二級(jí)結(jié)構(gòu)使oligo（dT）或基因特異引物很難與mRNA互補(bǔ)時(shí)，選擇隨機(jī)六聚寡核苷酸引物不失為一種良策

14、。RTPCR的產(chǎn)物產(chǎn)率很低？ 答：可能是因?yàn)榉崔D(zhuǎn)錄cDNA合成效率低，但更多情況下是因?yàn)閏DNA擴(kuò)增效率低。為了驗(yàn)證后者的可能性，可建立一系列PCR反應(yīng)，這些PCR加入了不同數(shù)量的模板。假如染色后的凝膠上呈現(xiàn)不清晰的成片狀的非特異性條帶，這種實(shí)驗(yàn)結(jié)果往往是在PCR中加入過量的cDNA模板所致。因此，在許多PCR實(shí)驗(yàn)中用反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)產(chǎn)生的cDNA的10作為模板。在這種情況下，PCR擴(kuò)增階段需要另加模板。具體最適合的模板量，要靠預(yù)實(shí)驗(yàn)確定。一旦建立了模板的最佳濃度，其他的PCR參數(shù)可用系統(tǒng)的方式如改變Mg2濃度和復(fù)性條件來進(jìn)一步優(yōu)化。2、上述調(diào)整后問題依然存在，怎么辦？答：1、通過含有甲醛的瓊脂糖凝

15、膠電泳來檢查RNA的完整性。2、建立含有對照mRNA、oligo(dT)引物和放射性元素標(biāo)記示蹤物的檢測反應(yīng)來檢測cDNA的合成效率。3、將不同比例的RNA樣品和對照樣品混合，通過比較cDNA的產(chǎn)量來檢測RNA樣品中是否存在抑制劑。4、在繼續(xù)進(jìn)行PCR之前，純化cDNA第一鏈的樣品。3、RTPCR反應(yīng)后，無PCR產(chǎn)物，怎么辦？答：首先應(yīng)嚴(yán)格按照說明書要求，進(jìn)行control反應(yīng)。如果對照正常，說明實(shí)驗(yàn)操作方面沒有問題。應(yīng)從RNA樣品的純度和添加量、引物的設(shè)計(jì)情況，參考文獻(xiàn)的可信度以及RTPCR條件的設(shè)定等方面加以考慮；如對照反應(yīng)不正常，應(yīng)從實(shí)驗(yàn)操作的準(zhǔn)確性、實(shí)驗(yàn)器具的處理、PCR儀的條件設(shè)定等

16、方面加以考慮。4、有些RT反應(yīng)體系中，不加dNTP混合物，為什么？答：由于在這些RT反應(yīng)體系中已經(jīng)加了足夠量的dNTP Mixture，因此在PCR反應(yīng)中，不須再添加dNTP。如果在PCR反應(yīng)時(shí)繼續(xù)添加，雖然PCR反應(yīng)仍可進(jìn)行，但可能會(huì)降低DNA的擴(kuò)增效率。RT-PCR的實(shí)驗(yàn)條件具有個(gè)性化網(wǎng)上的一個(gè)例子：我覺得做RT-PCR的方法和條件及應(yīng)注意的事項(xiàng)就是那么幾條,許多專業(yè)書都有詳細(xì)的描述,但是許多人還是歷經(jīng)多次磨難，有時(shí)就是得不出結(jié)果。因此，我認(rèn)為因?yàn)槊總€(gè)人所要克隆的片斷不同，引物不同等，因此對不同的人來說還是有他自己的特殊性,我的以下經(jīng)歷說明：做實(shí)驗(yàn)時(shí)各人的情況不同,做不出時(shí)還是要好好動(dòng)一下腦子。 記得我開始我的PCR時(shí)，按常規(guī)方法，提取總后，首先用自己設(shè)計(jì)的下游引物進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，不斷改變反應(yīng)條件，進(jìn)行了次均