沙棗花黃酮成分的含量測定及其藥理作用的初步研究

1、沙棗花黃酮成分的含量測定及其藥理作用的初步研究【摘要】目的參照中國藥典(2022版)測定沙棗花(Elaeagnusangustifliablsss，EAB)中總黃酮和蘆丁的含量，并初步討論沙棗花醇提物(thealhlextratfElaeagnusangustifliablsss，AE-EAB)對四氯化碳(l4)誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用。方法參考?中國藥典?通過分光光度法和高效液相色譜法測定EAB中總黃酮和蘆丁的含量，并通過測定小鼠血清中谷丙轉(zhuǎn)氨酶(ALT)、谷草轉(zhuǎn)氨酶(AST)的活性和肝組織勻漿中丙二醛(DA)的含量和超氧化物歧化酶(SD)、谷胱甘肽(GSH)的活性及觀察肝臟形態(tài)學(xué)改變

2、，研究不同劑量AE-EAB對小鼠l4急性肝損傷模型的保護(hù)作用。結(jié)果測得EAB中總黃酮的含量為27g/g，蘆丁的含量為0.029g/g。與l4誘導(dǎo)的肝損傷模型比擬,AE-EAB給藥組小鼠血清中ALT,AST活性明顯降低(P0.05),同時小鼠肝組織中DA含量明顯下降(P0.01),GSH含量有所升高(P0.05),SD活力明顯增強(qiáng)(P0.01)。形態(tài)學(xué)觀察,AE-EAB能明顯減輕l4對肝組織的損傷。結(jié)論EAB含有黃酮類化合物，AE-EAB對l4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷具有保護(hù)作用?！娟P(guān)鍵詞】沙棗花;黃酮;急性肝損傷;四氯化碳Abstrat：bjetiveTdeterinethententsfttal

3、flavnidsandrutininElaeagnusangustifliablsss(EAB)ardingtTehnialStandardFrhinesePharapEia(2022versin),andtstudytheprtetiveeffetsfthealhlextratfElaeagnusangustifliablsss(AE-EAB)nautehepatiinjuryinduedbyarbntetrahlride(l4)inie.ethdsSpetrphtetriethdandhighperfraneliquidhratgraphyereusedtdeterinethentents

4、fttalflavnidsandrutininEAB，ardingtTehnialStandardFrhinesePharapEIa(2022versin).ThelevelsfALT,ASTinseruandDA,SDandGSHinliverereeasuredandthehepatihistlgialhangeserebservedbyptialirspeinrdertstudytheprtetiveeffetsfdifferentdsesfalhlextratfAE-EABnautehepatiinjuryinduedby0.1%l4inie.ResultsThententfttalf

5、lavnidsfEABis27g/g(27gttalflavnidsin1gEAB),andthatfrutinas0.029g/g(0.029grutinin1gEAB).paredithdelgrup,thelevelsfALT,ASTinseruerebviuslydereased(P0.05),andthelevelfDAinliverasalslered(P0.05),buttheativitiesfGSHandSDinlivererearkedlyiprved(P0.05，P0.01)afterpretreatentithAE-EAB.AE-EABaeliratedthehepat

6、ipathlgialhangest.nlusinTheresultsshthatEABntainsflavnids,andAE-EABhasprtetiveeffetsnautehepatiinjuryinduedbyl4inie.Keyrds：EAB;Flavnids;Autehepatiinjury;arbntetrahlride沙棗花為胡頹子科植物沙棗ElaeagnusangustifliaL.的花,主產(chǎn)于西北地區(qū)。寧夏沙棗樹抗旱耐堿,具有很強(qiáng)的生命力,也是寧夏防風(fēng)固沙的重要植物。沙棗花呈銀白色，下垂，花呈漏斗形，長57。據(jù)?中藥大辭典?記載,沙棗花主要含山萘酚、花白素、脂肪油和少量揮發(fā)

7、油,具有止咳平喘的功能,可用于治療慢性氣管炎1。目前對沙棗花研究較多的是其揮發(fā)油成分2。本研究通過分光光度法測定了沙棗花醇提物中總黃酮的含量,結(jié)果測得沙棗花中總黃酮的含量為27g/g(即1g沙棗花乙醇提取物中含總黃酮27g);通過高效液相色譜法高效液相測定沙棗花乙醇提取物中蘆丁的含量，結(jié)果測得沙棗花乙醇提取物中蘆丁的含量為0.029g/g(即1g沙棗花乙醇提取物中含蘆丁0.029g)，說明沙棗花中含有黃酮類物質(zhì)。本文還對沙棗花醇提取物浸膏對l4所致小鼠急性肝損傷的保護(hù)作用做了初步研究,為進(jìn)一步開發(fā)應(yīng)用沙棗花提供一些實(shí)驗(yàn)根據(jù)。1材料與儀器1.2試劑丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶(AS

8、T)、超氧化物歧化酶(SD)、丙二醛(DA)、谷胱甘肽(GSH)測定試劑盒(南京建成生物工程研究所);甲醇為色譜純(天津市江天化工技術(shù)),水為超純水,其它試劑均為分析純。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(寧夏醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院提供)。1.3藥材沙棗花采自寧夏醫(yī)學(xué)院旁沙棗林，經(jīng)寧夏區(qū)藥品檢驗(yàn)所中藥研究室主任韓文欣鑒定為胡頹子科植物沙棗樹ElaeagnusangustifliaL.的新穎花序。1.4儀器高效液相色譜儀(日立DELL-2100/2130);AllSPhereDS18(4.6250)色譜柱;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮);SHB-III型循環(huán)式多用真空泵(鄭州長城科工貿(mào));KQ-3200DE數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲

9、儀器);ili-Q超純水儀(法國);電子天平(梅特勒-托利多儀器);721分光光度計(jì)(北京瑞利分析儀器公司);高速低溫離心機(jī)(日立公司F16RX);恒溫水浴鍋(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備)。2方法與結(jié)果2.1分光光度法測定沙棗花總黃酮的含量32.1.1對照品溶液的制備精細(xì)稱取在120枯燥至恒重的蘆丁對照品50g,置于25l量瓶中,加甲醇適量,置水浴上微熱使溶解，放冷，加甲醇至刻度，搖勻。精細(xì)量取10l,置100l量瓶中，加水至刻度，搖勻，即得(每毫升中含無水蘆丁0.2g)。2.1.2標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備精細(xì)汲取標(biāo)準(zhǔn)溶液1，2.3，3，4，5，6l置25l量瓶中,各加亞硝酸鈉溶液1.00l,混勻,放置顯色6in

10、,加10%硝酸鋁溶液1l,搖勻，放置6in，加氫氧化鈉試液10l,再加水至刻度，搖勻，放置15in，以相應(yīng)試劑為空白，按照紫外-可見分光光度法在500n波長處測定吸光度，以吸光度為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。其回歸方程Y=10.31X-0.0035,相關(guān)系數(shù)r=0.9985,線性關(guān)系良好。2.1.3測定法取本品粗粉1g，精細(xì)稱定，置索氏提取器中，加石油醚適量，加熱回流至提取液無色，放冷，棄去乙醚液。再加甲醇90l，加熱回流至提取液無色，轉(zhuǎn)移至100l量瓶中，用甲醇少量洗滌容器，洗液并入同一量瓶，加甲醇至刻度，搖勻。精細(xì)量取10l,至100l量瓶中，加水至刻度，搖勻。精細(xì)量取3l，置25

11、l量瓶中，照標(biāo)準(zhǔn)曲線制備項(xiàng)下的方法，自“加亞硝酸鈉起依法測定吸光度，測得吸光度值為0.030，從標(biāo)準(zhǔn)曲線上算得供試品溶液中總黃酮的濃度為0.00324g/l，即算得沙棗花中總黃酮的含量為27g/g(即每克沙棗花中含有總黃酮27g)。2.2RP-HPL色譜法測定蘆丁的含量32.2.1標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備取蘆丁對照品溶液(0.1g/l)分別進(jìn)樣,進(jìn)樣體積分別為1，2，4，6，8，10，35，40l,測定峰面積,以進(jìn)樣量為橫坐標(biāo),峰面積A為縱坐標(biāo),得回歸方程為A=6.9109+191498,相關(guān)系數(shù)為r=0.9998,蘆丁在0.386.08g范圍內(nèi)成良好的線性關(guān)系。見圖1。2.2.2色譜條件色譜柱為DS1

12、8(4.6250),檢測波長360n,柱溫為室溫(30),流速1.0l/in,流動相為甲醇-水-冰醋酸(3562.42.6)。2.2.3供試品溶液制備及蘆丁的含量測定取沙棗花粗粉1g，精細(xì)稱定，置具塞錐形瓶中，精細(xì)參加甲醇50l，稱定重量，超聲處理(功率250，頻率25kHz)30in，放冷，再稱定重量，用甲醇補(bǔ)足減失的重量，濾過。精細(xì)量取濾液5l，置25l量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。用0.45微孔濾膜過濾,進(jìn)樣10l按“2.1.1項(xiàng)下色譜條件注入色譜儀,測峰面積。結(jié)果測得沙棗花乙醇提取物中蘆丁的含量為0.029g/g(即每克沙棗花乙醇提取物中含蘆丁0.029g)。見圖2。

13、2.2.4沙棗花醇提物浸膏的制備1.0kg沙棗花切碎后,加3倍量80%乙醇加熱回流提取(1h3),合并濾液,減壓濃縮,得121.3g沙棗花浸膏。2.2.5沙棗花浸膏最大給藥劑量的測定4安康昆明種小鼠40只，1822g，雌雄各半，分兩組，沙棗花醇提物灌胃，0.4l/只(最大容積，最大耐受量)，給藥前禁食10h，正常飼水。觀察14d，記錄小鼠一般狀況改變及死亡數(shù)。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，給藥后1020in呼吸加快，1h后呼吸平穩(wěn)。觀察1周未見小鼠外觀及行為有任何變化，未見小鼠死亡。因此灌胃最大耐受量為16.0g/kg。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2.2.6l4誘導(dǎo)的小鼠急性肝損傷模型的建立4昆明種小鼠60只,雌雄各半

14、,將小鼠隨機(jī)分成6組,每組10只。分別為正常對照組，l4模型組，陽性藥(聯(lián)苯雙酯滴丸)對照組(0.2gkg-1)、沙棗花浸膏高(16gkg-1)，中(8gkg-1)，低(4gkg-1)劑量組,灌胃給藥21d,同時模型組和正常對照組分別給予同體積生理鹽水。于第21天給藥2h后,每鼠ip10lkg-1,0.1%l4橄欖油溶液,正常對照組給等量的橄欖油溶液，禁食,不禁水。造模16h后,眼球取血,血液3000rin-1離心10in,取血清超低溫冰箱-80凍存以備下一步檢測所需。采血后,快速斷頭處死，取肝右葉組織0.5g,在冰生理鹽水中漂洗,濾紙拭干,用生理鹽水制成10%肝組織勻漿,離心,取上清液待測。

15、同時取左葉肝臟,4%多聚甲醛固定作病理切片。測定指標(biāo)：血清ALT、AST,按試劑盒要求進(jìn)展測定;肝組織勻漿SD、DA和GSH,按試劑盒要求進(jìn)展測定;取肝左葉同一部位組織,用常規(guī)石蠟包埋,切片,HE染色,光鏡下觀察肝組織的形態(tài)學(xué)變化。統(tǒng)計(jì)學(xué)處理：采用SPSS12.0統(tǒng)計(jì)軟件，數(shù)據(jù)以s表示。組間采用t檢驗(yàn)，P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2.3血清生化指標(biāo)檢測結(jié)果說明,皮下注射l4可引起小鼠急性肝損傷,表如今血清中ALT,AST活性明顯升高。AE-EAB各劑量組均可使其升高的ALT,AST活性顯著降低(P0.05或P0.01),提示AE-EAB對l4引起的小鼠急性肝損傷有很好的保護(hù)作用。見表1。表1

16、AE-EAB對急性肝損傷小鼠血清ALT,AST的影響與正常對照組比擬,*P0.05，*P0.01;與模型對照組比擬,P0.05,P0.01;n=102.4肝組織勻漿生化指標(biāo)檢測從實(shí)驗(yàn)結(jié)果可見,模型組小鼠肝組織中DA含量明顯升高(P0.01),SD與GSH活性顯著下降(P0.01),提示肝臟出現(xiàn)脂質(zhì)過氧化。而AE-EAB各劑量組均可顯著抑制肝組織中DA的升高,而SD,GSH活性明顯升高(P0.01或P0.05),提示AE-EAB有較強(qiáng)的抗氧化及去除氧自由基的作用。結(jié)果見表2。表2AE-EAB對急性肝損傷小鼠肝組織SD,DA和GSH的影響與正常對照組比擬,*P0.05，*P0.01;與模型對照組比

17、擬,P0.05,P0.012.5肝臟組織病理學(xué)觀察正常對照組小鼠肝臟外觀呈紅褐色,質(zhì)地軟而富有彈性;在光鏡下可以觀察到肝小葉構(gòu)造完好,細(xì)胞排列整齊,大小均勻,分界清楚，無炎細(xì)胞浸潤(圖3-A)。模型組小鼠肝臟體積增大,質(zhì)脆,邊緣鈍而厚,外表呈黃褐色，有暗紅色出血點(diǎn);鏡下見肝小葉構(gòu)造破壞,肝細(xì)胞核消失，出現(xiàn)以中央靜脈為中心的局灶性肝細(xì)胞變性、壞死和大量炎細(xì)胞浸潤(圖3-B)。聯(lián)苯雙酯組(圖3-F)和AE-EAB(圖3-E)高劑量組肝臟略有水腫,質(zhì)地柔軟;鏡下見肝小葉構(gòu)造根本完好,細(xì)胞排列較整齊,只有少量的炎細(xì)胞浸潤,較模型組有明顯改善。AE-EAB(圖3-D)中劑量與低劑量組(圖3-)與模型組相

18、比變化不明顯(圖1)。3討論肝炎是一種發(fā)病率高,難以根治的疾病,對人類安康危害極大,而且不良的飲食習(xí)慣、外界環(huán)境等均能導(dǎo)致肝臟疾病,損害肝細(xì)胞。在肝細(xì)胞病變過程中,自由基、酶及脂質(zhì)過氧化等均發(fā)揮重要作用5，l4是誘導(dǎo)化學(xué)性肝損傷的常用藥物,在體內(nèi)經(jīng)肝臟細(xì)胞色素P450激活生成三氯甲基自由基(l3)二氯甲烷自由基(l2)等,引起膜的脂質(zhì)過氧化,使肝細(xì)胞膜通透性增加,引起肝細(xì)胞嚴(yán)重受損,細(xì)胞內(nèi)轉(zhuǎn)氨酶易穿過細(xì)胞膜而釋放入血液6。DA是脂質(zhì)過氧化降解的主要產(chǎn)物,其含量反映了組織脂質(zhì)過氧化損傷程度的大校SD和GSH是細(xì)胞內(nèi)主要的抗氧化酶類,可去除機(jī)體內(nèi)過多的自由基,激活或調(diào)動機(jī)體中的內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng),預(yù)

19、防或減輕自由基損傷。DA的測定常常與SD的測定互相配合,SD活力的上下間接反映了機(jī)體去除氧自由基的才能,而DA的上下又間接反映了機(jī)體細(xì)胞受自由基攻擊的嚴(yán)重程度7，8,GSH廣泛存在于人體的各種組織中，GSH程度降低意味著機(jī)體抗氧化才能下降并引發(fā)機(jī)體的氧化應(yīng)激反響,產(chǎn)生大量的自由基。在肝臟化學(xué)性損傷時,氧化應(yīng)激消耗GSH引起肝組織中GSH含量下降,機(jī)體抗氧化才能下降并引發(fā)機(jī)體的氧化應(yīng)激反響9。大量實(shí)驗(yàn)說明10：各種黃酮類化合物如黃酮類、黃酮醇類、二氫黃酮類、異黃酮類、黃烷酮類等對化學(xué)性肝損傷、藥物性肝損傷、免疫性肝損傷、酒精性肝損傷、缺血/再灌注性肝損傷等實(shí)驗(yàn)性肝損傷均有不同程度的保護(hù)作用，這種

20、保護(hù)作用與黃酮化合物去除自由基、抗氧化、抗脂質(zhì)過氧化反響、調(diào)節(jié)免疫功能等有關(guān)，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果說明,沙棗花醇提物能降低l4誘導(dǎo)的急性肝損傷小鼠血清中ALT和AST的程度,減輕肝細(xì)胞的炎性浸潤和變性壞死等病理改變,同時還明顯降低肝組織中DA的含量,并進(jìn)步SD和GSH的活力。降低機(jī)體內(nèi)自由基的含量，進(jìn)步機(jī)體的抗氧化才能。我們也對沙棗花醇提物做了總黃酮的測定，并用高效液相色譜法分析了沙棗花醇提物中蘆丁的含量，發(fā)現(xiàn)沙棗花中含有黃酮類化合物。綜上所述,沙棗花醇提物可以抑制自由基誘導(dǎo)的肝臟脂質(zhì)過氧化損傷作用,進(jìn)步機(jī)體去除氧自由基才能,維持細(xì)胞膜構(gòu)造和功能的完好性,從而對l4誘導(dǎo)的化學(xué)性肝損傷起一定的保護(hù)作用，但到底是不是沙棗花中的黃酮類物質(zhì)對實(shí)驗(yàn)性肝損傷起保護(hù)作用以及其作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1南京中醫(yī)藥大學(xué).中藥大辭典，第2版，上冊.上海：上?？茖W(xué)技術(shù)出版社，2022：1630.2王妍，李玲，連松剛，等.頂空-固相微萃取氣質(zhì)聯(lián)用分析寧夏沙棗花中香氣成分J.中草藥，2022,38(11):1627.3國家藥典委員會.中國藥典，I部S.北京：化學(xué)工業(yè)出版社，2022.4