非清髓異基因外周血造血干細胞移植后嵌合體分析

1、非清髓異基因外周血造血干細胞移植后嵌合體闡發(fā)陳寶安，熊輝霞，丁家華，蘇恩本，趙剛，王駿，高沖，孫耘玉，程堅【摘要】本研究旨在探究非清髓異基因外周血造血干細胞移植(NAPBST)后造血嵌合體的臨床意義。接納FB(氟達拉賓+白消安+環(huán)磷酰胺)阿糖胞苷Ara-預處置懲罰方案，對28例血液病患者舉行NAPBST，網(wǎng)羅供者和受者術(shù)前外周血及術(shù)后差異時間段的序列血樣，用STR-PR團結(jié)聚丙烯酰胺凝膠電泳、銀染色和凝膠成像闡發(fā)技能半定量要領盤算供體細胞嵌合率。效果表現(xiàn)：移植后1月，28例患者中1例移植失敗，22例形成完全供者造血嵌合體()，5例形成混淆造血嵌合體()；移植后7天時供者細胞即占上風74.71%

2、，較中性粒細胞AN和血小板Plt的均勻規(guī)復時間均顯著提早；組的aGVHD產(chǎn)生率高于組P0.05，兩組GVHD產(chǎn)生率無明顯差異P0.05；1例患者產(chǎn)生早期移植排擠；組和組復發(fā)率無明顯差異P0.05，1例在狀態(tài)下復發(fā)。3例患者經(jīng)早期臨床干預治療得到和完全緩解。結(jié)論：造血嵌合體的動態(tài)定量檢測對斷定早期植入，猜測移植物排擠、復發(fā)和GVHD，以及引導臨床干預治療具有緊張意義?！娟P(guān)鍵詞】非清髓造血干細胞移植AnalysisfHeatpietihierisafterNn-yelablativeAllgenEiPeripheralBldSteellTansplantatinKeyrdsnn-yelablati

3、vesteelltransplantatin;nn-yelablativeallgeneiperipheralbldsteelltransplantatin;TR-PR;heatpietihieris非清髓異基因造血干細胞移植NAST時由于減量的放、化療預處置懲罰加上強效的免疫按捺，在移植后多形成供、受體細胞差異比例的混淆嵌合體1，2，并呈動態(tài)變革。造血嵌合體的動態(tài)定量檢測對斷定早期植入、移植物排擠和白血病復發(fā)、把握GVHD的產(chǎn)生紀律、實行臨床干預治療、淘汰移植相干并發(fā)癥、進步療效都具有緊張意義。我們接納STR-PR團結(jié)凝膠電泳成像闡發(fā)技能對28例擔當NAST治療的患者舉行了嵌合體的動態(tài)監(jiān)測，

4、并對其臨床意義舉行了闡發(fā)。質(zhì)料和要領病例及供者2022年1月至2022年3月在我院血液科擔當非清髓異基因外周血造血干細胞移植的患者28例，男19例，女9例，年事15-58歲，中位年事37歲。此中慢性粒細胞白血病L19例，慢性淋巴細胞白血病(LL)1例，急性非淋巴細胞白血病(AL)3例，骨髓增生非常綜合征(DS)4例，非霍奇金淋巴瘤(NHL)1例。供者28人，此中同胞供者24人，無血緣干系供者2人，HLA配型均為全相合；單倍相合親緣供者2例，均DR位點不合。供、受者性別相合18例，性別不合10例。AB血型相合21例，血型不合7例。供、受者詳細環(huán)境見附表。要領非清髓性預處置懲罰接納FB預處置懲罰方

5、案，即氟達拉賓Flud30g/2，于移植前7-2天靜脈點滴；白消安BU4g/kgd，移植前6-5天，口服；環(huán)磷酰胺(Y)350g/2d，移植前3-2天靜脈點滴，急性白血病和疾病希望期患者加用阿糖胞苷Ara-。外周血干細胞的發(fā)動和回輸全部供者用重組人粒細胞集落刺激因子(rhG-SF)發(fā)動外周血干細胞，5g/kgd皮下注射，共5天，第5，6天用S-3000Plus血細胞分散機(Baxter公司)分散外周血干細胞2次，每次循環(huán)血量10L擺布。全部患者均擔當未去T細胞移植物，輸注單個核細胞數(shù)N均勻為6.3108/kg，D34+細胞數(shù)均勻為4.8106/kg。GVHD的防治接納環(huán)孢菌素AsA團結(jié)驍悉(F

6、)方案，即sA3g/kgd，移植前1天開始賜與，一連24小時靜脈滴注，正常進食后改為口服，維持血藥濃度在200-400ng/L，至100天停藥。F1.0/d，分2次口服，從移植后1-27天應用。無關(guān)供者移植的病例加用短程甲氨蝶呤TX，即移植后第1天為15g/2，第3，6，11天為10g/2，靜脈滴注。嵌合體檢測術(shù)前網(wǎng)羅供者和受者外周血2l，術(shù)后7、14、21和30天網(wǎng)羅患者外周血，今后按照患者隨訪時間網(wǎng)羅外周血，每月1次或每3月1次。移植后早期每次采血5l，今后每次2l，AD抗凝，于采血后24小時內(nèi)用紅細胞裂解液裂解紅細胞，提取白細胞，helex-100法快速提取基因組DNA。按文獻選擇D5S

7、818、D13S317、D3S1358、D8S1179、D7S820、D16S539、FGA、vA8個STR位點舉行PR擴增3，4，經(jīng)非變性非一連聚丙烯酰胺凝膠電泳，硝酸銀染色法斷定PR擴增產(chǎn)物，末了用UVP凝膠成像闡發(fā)儀舉行掃描成像闡發(fā)，選擇各自的嵌合體盤算公式5，以供、受者特異性等位基因帶的峰面積比值盤算嵌合率，效果取全部I類和類位點的均勻值6。嵌合體界定供體細胞D95%為完全嵌合體，5%D95%為混淆嵌合體7。Table.linialharateristisfpatientsanddnrs略統(tǒng)計學處置懲罰題應用SAS8.0統(tǒng)計軟件舉行闡發(fā)，接納Fisher準確概率法盤算P值。效果造血嵌合

8、體的形成和演變以移植后1月為界斷定造血細胞嵌合體，28例患者中1例DS-RA的患者移植失敗未檢測到嵌合體，自體造血亦未規(guī)復而死于嚴峻熏染。余27例患者均形成差異比例的造血嵌合體，此中22例形成81.48%，5例形成18.52%。隨訪1.5-27月，均勻11個月，22例患者中3例隨后出現(xiàn)D落落和受者身分的增長，并相繼出現(xiàn)白血病復發(fā)；1例在狀態(tài)下復發(fā)，18例保持不變。5例患者中，1例LL患者早期出現(xiàn)移植排擠，經(jīng)2次供者淋巴細胞輸注DLI后漸漸到達；2例早期復發(fā)，此中1例殞命，1例經(jīng)二次尺度移植后得到；1例起首出現(xiàn)細胞遺傳學復發(fā)，D進一步落落，敏捷變化為完全受者型造血，臨床血液學復發(fā)；另1例患者移植

9、1個月后三系細胞舉行性落落，脾腫大，骨髓增生顯著活潑，診斷脾成效亢進，STR-PR查抄一連，移植后4個月時行脾切除治療，8個月時轉(zhuǎn)為。造血嵌合體與造血規(guī)復從移植0天開始血通例監(jiān)測，天天1次，造血規(guī)復后改為每周3次至移植后1個月，造血重修的尺度為AN0.5109/L和Plt20109/L8。在得到造血重修患者中，AN最低的均勻時間是6.59天2-10天，AN0.5109/L的均勻時間是11.68天8-15天，Plt最低的均勻時間是8.40天4-12天，Plt20109/L的均勻時間是16.24天9-35天。全部不變植入的患者在移植后7天時的均勻嵌合率是74.71%，移植后14天多數(shù)病例達。造血嵌

10、合體與GVHD在形成造血嵌合體的27例患者中，共計有18例66.67%產(chǎn)生了aGVHD。在組17/22例77.27%產(chǎn)生了aGVHD，此中-級12例，-級5例；組1/5例20%產(chǎn)生級aGVHD，組aGVHD產(chǎn)生率高于組P0.05。在可評估的患者中，共有12/21例57.14%產(chǎn)生了GVHD，組11/17例64.71%，此中普及型GVHD4例，范圍型GVHD7例；組僅1/4例產(chǎn)生范圍型GVHD25%，但因例數(shù)較少，差異無統(tǒng)計學意義P0.05。5例產(chǎn)生胃腸道和或肝臟嚴峻aGVHD的患者中，4例在治療歷程中因病情難以操縱或經(jīng)濟緣故原由放棄治療在移植后3個月內(nèi)殞命，1例治療后病情好轉(zhuǎn)，但遷延為GVHD

11、，于移植1年后死于GVHD。造血嵌合體與移植排擠和白血病復發(fā)本研究中僅1例LL患者產(chǎn)生早期移植排擠，移植后1個月時僅在部門STR位點有少量的供者型遺傳標識表記標幟存在D27%，但血通例查抄提示造血規(guī)復，思量為早期移植排擠，自身造血規(guī)復，實時賜與DLI治療2次，移植后3個月時已靠近D90%。7例出現(xiàn)疾病復發(fā)，時間在移植后1.5-16月，此中組4/22例18.18%，組3/5例60%，但因例數(shù)較少，兩組差異無明顯性P0.05。復發(fā)的患者中5例為移植前處于疾病希望期或?qū)掖螐团e事治性病例。值得留意的是，1例AL的女性患者一連保持及無白血病保存狀態(tài)達16月，診斷血液學復發(fā)時外周血STR-PR查抄仍提示，

12、該患者在復發(fā)前并無的過渡狀態(tài)圖1。造血嵌合體與臨床干預治療對處于狀態(tài)和出現(xiàn)D落落的患者，為防范復發(fā)和移植排擠，都舉行了臨床干預治療，3例獲得了較好療效。1例早期移植排擠的LL患者在顛末2次DLI后漸漸到達，現(xiàn)已無病保存12個月。復發(fā)最早的1例25歲的男性患者來我院查抄時已為慢性粒細胞白血病遽變期，因病情希望快，未予化療，直接用其母作為供者舉行移植，移植后1個月時STR-PR查抄D在60%，行DLI1次，并淘汰免疫按捺劑的用量，移植后1.5月時外周血涂片原始細胞比例30%，立即經(jīng)尺度預處置懲罰后予第2次移植，移植后50天時達，維持無白血病保存狀態(tài)8個月，終極死于二次復發(fā)。尚值得留意的是，1例移植

13、后歸并全血細胞淘汰診斷脾成效亢進的L患者在移植后8個月切脾治療后血象規(guī)復的同時由嵌合狀態(tài)轉(zhuǎn)為，現(xiàn)已無病存活25個月圖2。討論嵌合體形成受到疾病自己、預處置懲罰方案、輸入干細胞的數(shù)目、移植物是否去除T細胞、檢測要領的敏感性和檢測時間等多種因素的影響9。本研究病例形成完全嵌合體的比例高81.48%，且得到時間較早多數(shù)病例在移植后14天達，這大概與我們接納的預處置懲罰方案較強，同時輸入了較多量外周血T細胞有關(guān)。Yshida等10指出，非清髓性預處置懲罰強度有很大的范疇，一樣平常來說，用含氟達拉賓的預處置懲罰方案作用較強，多形成，而用含ATG，TBI的方案那么40%形成，但可通過DLI變化為，畢竟接納

14、何種預處置懲罰方案，應按照復發(fā)率決定。因此，單純從形成嵌合體形成范例方面評價預處置懲罰方案的優(yōu)劣是不全面的，必需從遠期和團體療效加以斷定。選擇預處置懲罰方案應思量受者底子疾病的性子和狀態(tài)，受者的年事、臟器成效、并發(fā)癥及HLA相合環(huán)境等。造血規(guī)復是斷定移植樂成與否的緊張指標，但NAST后縱然未樂成植入，自身造血也有大概規(guī)復，因此不克不及斷定造血泉源，不克不及去除成份輸血造成的假象。Dubusky等11將移植后供者細胞初次占上風的時間，即D初次大于50%的時間界說為分子程度植入，一樣平常比造血重修早4-7天，本研究得到不變造血重修的患者在移植后7天時供者細胞就占上風D74.71%，這比AN和Plt

15、均勻規(guī)復時間顯著提早，因此縱然在移植早期造血按捺期間，也能斷定移植樂成與否。異基因造血干細胞移植后GVHD制約著其在臨床上的應用，人們不停在探究怎樣減輕GVHD而不淘汰GVL效應。理論上NAST通過誘導供受者雙向免疫耐受，可使GVHD的產(chǎn)生率低且程度輕。但本研究中GVHD的總產(chǎn)生率和相干殞命率都較高，且組aGVHD產(chǎn)生率顯著高于組，這一效果大概與我們接納的預處置懲罰方案較強且移植物未去T細胞，得到較快有關(guān)。有學者以為，先顛末高比例再漸漸轉(zhuǎn)化為大概是一種更好的避開aGVHD的植入方法12。D的定量檢測，尤其是供者T細胞亞群的監(jiān)測有助于創(chuàng)造GVHD的高?；颊?，利于增強GVHD的防治。有關(guān)與復發(fā)的干

16、系，如今存在較多爭議。多數(shù)研究以為，與較高的復發(fā)率相干，一連那么與低產(chǎn)生率的復發(fā)相干聯(lián)11，13。但有研究得出的結(jié)論是自己不表白預后差，受者身分的突然增長預示復發(fā)9。本研究中，復發(fā)的7例患者中5例為處于疾病希望期或?qū)掖螐团e事治性病例，組和組復發(fā)率無明顯差異，與Furukaa等14的研究效果相似。隨著對細胞亞群嵌合體研究的深化，創(chuàng)造髓系混淆嵌合體與髓系白血病的復發(fā)有關(guān)，而與淋巴體系白血病的復發(fā)無關(guān)5，13，15。值得留意的是，本研究中1例AL的女性患者一連保持及無白血病保存狀態(tài)達16個月，診斷血液學復發(fā)時外周血STR-PR查抄仍提示，即該患者在復發(fā)前并無的過渡狀態(tài)。李素霞等16也有雷同報道。這些

17、效果提示復發(fā)可以不陪同從完全供者嵌合體到混淆嵌合體的變化，思量緣故原由有兩方面，起首大概與嵌合體檢測要領的敏捷度有關(guān)，其次患者大概確實系供者型復發(fā)，但供者源性的白血病多與受者原有的白血病范例差異17。Bader等15說明此種征象大概是由于急性白血病復發(fā)較快，而檢測嵌合體的隔斷較長，恰好錯過了短暫的一過性狀態(tài)。因此對付某些大概在移植后短期內(nèi)復發(fā)的高?；颊撸琓hiede等18保舉應積極檢測嵌合體：移植后第1個月內(nèi)每周2次，移植后3個月內(nèi)每周1次，3個月后至少每月1次，一旦創(chuàng)造D落落，應盡早賜與干預性治療。嵌合體定量檢測技能現(xiàn)已成為RD的檢測本領之一，尤其是對付無特異性腫瘤標識表記標幟基因非常的惡性血液病患者更為實用。免疫按捺劑調(diào)解、DLI和第二次移植是NAST后重要的臨床干預治療，但自己應用不妥可帶來相干的毒性作用和并發(fā)癥，或延誤治療的機遇。造血嵌合體的動態(tài)定量檢測對實行臨床干預治療、進步療效具有緊張的引導代價13。我們研究的3例患者在嵌合體監(jiān)測下經(jīng)臨床干預治療獲得了較好療效。1例L遽變期移植后隨即復發(fā)的患者顛末第二次尺度移植，得到，并無病存活8個月，固然末了死于二次復發(fā)，但難治性白血病通過第二次移植能重新得到并到達完全緩解的樂成履歷也是令人煽動