預(yù)處理對(duì)在體大鼠冠脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)及機(jī)制探討

1、預(yù)處理對(duì)在體大鼠冠脈血管內(nèi)皮細(xì)胞的保護(hù)及機(jī)制討論【摘要】目的討論缺血預(yù)處理(IP)對(duì)缺血再灌注(I/R)所致的血管內(nèi)皮細(xì)胞(VE)損傷是否有保護(hù)作用及蛋白激酶(PK)在其中的作用。方法實(shí)驗(yàn)大鼠分為5組：對(duì)照組、缺血再灌注組(I/R組)、預(yù)處理組(IP組)、多黏菌素B(PK抑制劑)+I/R組、多黏菌素B+IP組。測(cè)定各組一氧化氮(N)、內(nèi)皮素(ET)、循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(E)、丙二醛(DA)，并作冠脈VE透射電鏡觀察。結(jié)果I/R后血漿中N明顯減少，ET明顯升高,N/ET值明顯降低，E明顯增多，DA明顯升高(P0.05或P0.01)。IP能逆轉(zhuǎn)上述改變,使血漿中N增多,ET降低,N/ET值恢復(fù),E數(shù)量減

2、少,DA含量降低(P0.05或P0.01)。PK的抑制劑多黏菌素B并不加重I/R的上述改變,但是能阻斷IP的作用。電鏡顯示：I/R后VE的超微構(gòu)造嚴(yán)重?fù)p傷，IP能明顯減輕VE的構(gòu)造損傷。結(jié)論I/R導(dǎo)致VE構(gòu)造和功能的嚴(yán)重?fù)p傷，IP能減輕I/R后VE的構(gòu)造和功能損傷，PK可能參與了這一過(guò)程?！娟P(guān)鍵詞】缺血再灌注損傷;缺血預(yù)處理;血管內(nèi)皮細(xì)胞;蛋白缺血預(yù)處理(IP)是指一次或?qū)掖味虝喝毖俟嘧?I/R)對(duì)隨后較長(zhǎng)時(shí)間的I/R心肌有保護(hù)作用，能減少I(mǎi)/R后心肌梗死面積，減輕再灌注心律失常的發(fā)生率和嚴(yán)重程度，恢復(fù)心室收縮功能。IP作為一種內(nèi)源性的強(qiáng)有力的心肌保護(hù)途徑，近年得到迅猛的開(kāi)展，成為心臟領(lǐng)域的

3、研究熱點(diǎn)。心臟I/R時(shí)不僅心肌細(xì)胞受損，血管內(nèi)皮細(xì)胞(VE)的構(gòu)造和功能亦受到嚴(yán)重?fù)p傷，甚至受損時(shí)間更早于心肌細(xì)胞1。目前IP主要集中于心臟，對(duì)血管內(nèi)皮的研究較少，本實(shí)驗(yàn)通過(guò)活體大鼠心臟研究，以討論IP能否減輕I/R后VE的損傷、保護(hù)VE，并討論了蛋白激酶(PK)在其中的作用。1材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)動(dòng)物安康成年雄性istar大鼠40只(10月齡，普通級(jí))，體重280320g，由昆明醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。1.2主要試劑多黏菌素B(Siga公司產(chǎn)品);二磷酸腺苷(ADP，Ares進(jìn)口分裝);一氧化氮(N)測(cè)試盒(購(gòu)自軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院);內(nèi)皮素(ET)放免試劑盒(購(gòu)自北京東亞免疫技術(shù)研究所);LP硫

4、代巴比妥酸(TBA)法試劑盒(由同濟(jì)醫(yī)科大學(xué)協(xié)和醫(yī)院心血管病生室提供)。1.4實(shí)驗(yàn)指標(biāo)的測(cè)定1.4.1循環(huán)內(nèi)皮細(xì)胞(E)測(cè)定采用Perell密度梯度離心法進(jìn)展，別離出的E經(jīng)間接熒光免疫法鑒定。1.4.2N測(cè)定將所采血1l，肝素抗凝后，以3000r/in，離心15in，取上清置于-20冰箱貯存?zhèn)錂z，詳細(xì)檢測(cè)按N測(cè)定試劑盒說(shuō)明進(jìn)展。1.4.3ET測(cè)定取血1l注入含10%EDTA二鈉30l和抑肽酶40l的試管中，混勻，43000r/in離心10in，取上清置-20貯存?zhèn)溆?，詳?xì)操作按ET放免試劑盒說(shuō)明進(jìn)展。1.4.4丙二醛(DA)測(cè)定取心肌組織400g，參加4l磷酸鹽緩沖液，制成10%的心肌勻漿，而

5、后按改進(jìn)硫代巴比妥酸法(TBA法)測(cè)定。1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所測(cè)數(shù)據(jù)用xs表示,采用SPSS11.0程序軟件包中的單因素方差分析,t檢驗(yàn)。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.2結(jié)果2.1各組血漿中N、ET含量及N/ET值比擬由表1可見(jiàn)，I/R使VE釋放N減少,ET增多,破壞二者之間的平衡,而IP能使這種平衡趨于恢復(fù)。多黏菌素B不影響I/R后N、ET的程度變化,但使IP恢復(fù)N/ET平衡的作用破壞,使N減少,ET增加。提示I/R時(shí)VE分泌N、ET功能失調(diào)，而IP能恢復(fù)VE這種分泌功能,使N產(chǎn)生增多，PK可能參與了這一作用。表1各組血漿中N、ET含量及N/ET值的比擬與對(duì)照組相比：1)P0.05,2)P0.01;與I

6、/R組相比：3)P0.05，4)P0.01;與IP組相比：5)P0.05,6)P0.01，下表同2.2各組E的數(shù)量和DA含量變化見(jiàn)表2，E形態(tài)多樣,大多數(shù)為極不規(guī)那么的多邊形,呈皺縮、扭曲或折疊狀。對(duì)照組E數(shù)量較少，I/R時(shí)血中E明顯增多(P0.01)，IP能明顯降低I/R所致的E增加(P0.05)，PK的抑制劑多黏菌素B并不增加I/R后E數(shù)量,但阻斷了IP的保護(hù)作用,使E明顯上升。I/R時(shí)DA明顯上升(P0.01)，而IP時(shí)DA明顯下降(P0.01)。多黏菌素B阻斷IP降低DA的作用,使DA明顯上升(P0.05)。表2各組E的數(shù)量和DA含量的比擬2.3VE超微構(gòu)造的變化對(duì)照組，細(xì)胞形態(tài)完好,

7、胞膜明晰,核區(qū)胞漿突入管腔，大局部胞漿延伸變薄，胞漿線粒體少而小,不含鈣粒,有豐富的質(zhì)膜小泡。I/R組，有的內(nèi)皮細(xì)胞腫脹,有的內(nèi)皮細(xì)胞皺縮變小，呈壞死狀,質(zhì)膜小泡消失,線粒體腫脹,并有空泡形成,胞漿中出現(xiàn)大的空泡,細(xì)胞間連接模糊。IP組，VE稍腫脹,形態(tài)完好,胞核胞質(zhì)正常,有質(zhì)膜小泡存在,線粒體不腫脹,無(wú)空泡形成,細(xì)胞間連接嚴(yán)密明晰。提示I/R使VE超微構(gòu)造嚴(yán)重?fù)p傷，加速VE的壞死，而IP能保護(hù)VE的超微構(gòu)造，減輕I/R對(duì)VE的構(gòu)造損傷。3討論正常血管內(nèi)皮可分泌一系列重要的血管活性物質(zhì)。N是血管內(nèi)皮釋放的重要舒血管物質(zhì)，集中代表了正常血管內(nèi)皮的功能，而ET那么是血管內(nèi)皮細(xì)胞釋放的縮血管物質(zhì)，具有強(qiáng)烈的縮血管作用。在正常情況下，上述兩種物質(zhì)的作用相對(duì)平衡，以舒血管物質(zhì)的作用略占優(yōu)勢(shì)，以保持血管壁的平滑和血流的通暢。I/R引起N減少，ET增多，使冠脈血管收縮，冠脈血流減少，加速心肌壞死。有研究說(shuō)明,I/R后VE功能損傷發(fā)生早,持續(xù)時(shí)間長(zhǎng),是缺血再灌注損傷(IRI)重要表現(xiàn)之一。冠狀動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞不僅是IRI的靶器官，也是心肌IRI的起始因子2。本實(shí)驗(yàn)提示I/R所致的內(nèi)皮依賴性舒張功能障礙可能主要是由于VE構(gòu)造完好性受損所致,而