相對(duì)熒光定量PCR三種常用方法、注意事項(xiàng)

1、相對(duì)定量方法實(shí)際操作（三種常用方法）本人用的是相對(duì)熒光定量PCR法，在分子水平上比較課題中5種新基因的表達(dá)差異。實(shí)驗(yàn)進(jìn)行很多次，感受頗深，同時(shí)遇到了 -些問題：擴(kuò)增效率,標(biāo)準(zhǔn)品選擇（及賦值）標(biāo)準(zhǔn)曲線、重復(fù) 性等問題，希望有同行朋友一起探討和指教。Comparative Delta-delta Ct 法定流程（RG6000 軟件設(shè)置）1）.先對(duì)樣品中的目的基因與看家基因分別做標(biāo)準(zhǔn)曲線，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線確定兩個(gè)基因的擴(kuò)增效率是否一致或接近；將擴(kuò)增效率優(yōu)化為一致。2）.同一樣品分別進(jìn)行看家基因和目的基因的擴(kuò)增，分列在兩頁中P1P21 I 1 相同的樣品在兩頁里命名成相 同的名稱，并定義為unknownI

2、分別分析P1和P2頁選 delta-delta Ct 選項(xiàng)T依次填入，并定義對(duì)照樣品完成分析公式：F=2-r待檢樣品目_待檢樣品看- F=2-r待檢樣品目_待檢樣品看- 的基因平均-家基因平均ct值 ct值對(duì)照組目的L基因平均ct 值對(duì)照組看家q 基因平均ct值Comparative Delta-delta Ct法的特點(diǎn)，注意事項(xiàng)及實(shí)際應(yīng)用. Comparative Delta-delta Ct法是很常用的一種相對(duì)定量方法，其最大特點(diǎn)是，當(dāng)優(yōu)化的體系已經(jīng)建立后，在每次實(shí)驗(yàn)中無需再對(duì)看家基因和目的基因 做標(biāo)準(zhǔn)曲線，而只需對(duì)待測樣品分別進(jìn)行PCR擴(kuò)增即可。.其缺點(diǎn)是，每次實(shí)驗(yàn)都默認(rèn)目的基因和看家基

3、因的擴(kuò)增效率一致，而并非真實(shí)擴(kuò)增情況的反映，這里勢(shì)必存在一定的誤差。. Comparative Delta-delta Ct法展開定量實(shí)驗(yàn)前，在預(yù)實(shí)驗(yàn)中，必需對(duì)目的基因和看家基因做兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線。Rotor-Gene的軟件會(huì)自動(dòng)給出兩組標(biāo)準(zhǔn)曲 線的R值、擴(kuò)增效率等信息，如果兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率，即M值的差小于 0.1，那么后續(xù)實(shí)驗(yàn)中就可以用Comparative Delta-delta Ct法進(jìn)行相對(duì)定量 分析。反之，如果M差值大于0.1,就無法用該方法進(jìn)行相對(duì)定量分析。此 時(shí)的解決方法有兩種，一是優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，使兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的斜率差值小于0.1, 二是換用其它的相對(duì)定量方法。應(yīng)用實(shí)例:腫 Quant

4、 - Result x 腫 Quant - Result x - Cjclxng FAM/Sjrhr ( _ | O | X | Slandar d Curve -A-FAV/Sj-br NdNarriETjpe | 口| GivenCmc |匚口口Cdc Cmc |Ci3j *1ijenraHrterest 1SlandaidE4 47LOOTTO2ijenraHrterest 1Slandaid&3LEOO3ijenraHrterest 1SlandaidW41 .roo124GBtiBaf lute rest 2Standard38.1210D!5GBtiBaf lute rest 2S

5、tandard27.9310D116GBtiBaf lute rest 2Standard10D17如Eufldtei做 3Slanddid32.03ID8如Eufldtei做 3Slanddid3147IDg如Eufldtei做 3Slanddid31.73ID1DGerie al InbsieEf 4-Sla-idsidssea1T|7|_. . . 1 .L. -L 4r i. j. jnj Ti11 ij-ODIW10-0210T13Conccrtrrtion1Q-T21如1Q-T2Ceding A.FVSYtar Page 11：1Q-T21如1Q-T2Ceding A.FVSYta

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7、nd ad3J.79wo7HwiseKerpefSrdwd2.37108Hixj&aKjdEpEfEtandiard2414109Hixj&aKjdEpEfEtandiard23.99101DSlardEfd27.811 I7|_1 *n”Rk. . J-.J41忌如上圖，將標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行梯度稀釋后，分別對(duì)目的基因(Gene of Interest)和看 家基因(Housekeeper Gene)做標(biāo)準(zhǔn)曲線。軟件自動(dòng)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，并給出相 應(yīng)的參數(shù)。從上圖可知，兩組標(biāo)準(zhǔn)曲線的M值分別為-3.525和-3.467，兩者的 差值0.1，因此，這組看家基因和目的基因可以用Comparative Delt

8、a-delta Ct 法兩進(jìn)行相對(duì)定量。在完成上述預(yù)實(shí)驗(yàn)之后，接下來就可以正式對(duì)待測樣品進(jìn)行定量分析。在該實(shí)驗(yàn)中，分別對(duì)待測樣品的看家基因和目的基因進(jìn)行擴(kuò)增，下圖即為一個(gè)標(biāo)準(zhǔn)的擴(kuò)增分析結(jié)果:TETTn-me-GrriCOTrircfilCeJc Ccfk |Ccpie|Vji |F4p ClRsp. Ct 9id Ffep. Cl 0351 Cl) I RSSrSKep Ol5：由g 1AUri-ncMnIB. 3015960.33 口4.90.1631|1HdLdtketpei G&e A15SflHduttpef Gw AHBjeekttpef fere AUrrKnikfflgHc.qr

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11、Hci.q?teza Qnuit i t ati onScatter Grajh Analysis iHdFoint Analysis Cducentrati oilShow即給出分 C口i。佇 Qh?iit1 iiatioia *阿-仁恒JRCuantitation Analjeis 一 CyclinE A.FAL.dF2/d2C：1rtorm.Fluixa.IJ50-.13身51035頃wDifaulL Krrwrts.Coapr Quant Results - Cycling &.F&1/cc-1GB 1G3 1E7 1?.E V6 17J 1Q11B.4 1B.G1C0E0 g婦e凹

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14、n1S5QBUrkncM1652-0UnkiwM17.00-CUrJcnovjn1679cUrl:nwn1&3GJ-Unknwn1S72JLiu-ur 如!女9QHAverw Ampfihcalicri 1.76+0117|娘.如而 dtcswCalitwatof R用敝 r -上圖左下方即相對(duì)表達(dá)量的結(jié)果，其中Rep.Conc為樣品B、C相對(duì)于對(duì)照組A 的目的基因濃度。右側(cè)，可通過修改Calibrator Replicate改變對(duì)照組，以獲得 不同的比較結(jié)果。在Report中同樣給出拐點(diǎn)圖和相對(duì)定量的比值結(jié)果：Talks off Graph far Cycling A.FAMfSybrdF2VdECdF2VdEC5111jLu35 Lycfe-NhColour Nam