細(xì)胞生物學(xué)實(shí)驗(yàn)課細(xì)胞傳代與凍存

1、 實(shí)驗(yàn)三、細(xì)胞的傳代培養(yǎng)與凍存11.細(xì)胞培養(yǎng)中為什么NaHCO3？2.細(xì)胞培養(yǎng)中為什么添加血清？3.消化液胰酶的濃度是多少？2一、實(shí)驗(yàn)原理（一）傳代培養(yǎng) 1.傳代培養(yǎng)的概念 當(dāng)原代培養(yǎng)細(xì)胞或已成為細(xì)胞系的細(xì)胞，增殖達(dá)到一定密度后，將培養(yǎng)的細(xì)胞從一個(gè)容器以適當(dāng)比率轉(zhuǎn)移到另一個(gè)或幾個(gè)容器中擴(kuò)大培養(yǎng)，稱為傳代培養(yǎng)或繼代培養(yǎng)。32. 細(xì)胞傳代的意義與目的 防止細(xì)胞增殖過度、營養(yǎng)枯竭、酸中毒 維持細(xì)胞種的延續(xù)。 利用培養(yǎng)細(xì)胞進(jìn)行各種實(shí)驗(yàn)。4傳代中的 “代”與細(xì)胞世代中的 “代”不同傳代的頻率或間隔與培養(yǎng)液的性質(zhì)、接種細(xì)胞的數(shù)量和細(xì)胞增殖速度有關(guān)。 3. 需要注意的兩個(gè)問題5（二）培養(yǎng)細(xì)胞的種類貼壁細(xì)胞：

2、附著在一個(gè)固相支持物表面才能生長的細(xì)胞。如大部分的上皮來源的細(xì)胞。單層細(xì)胞，接觸抑制。半貼壁細(xì)胞：呈現(xiàn)貼壁生長現(xiàn)象，但不牢。懸浮細(xì)胞：不需附著在固相支持物表面，懸浮即可生長的細(xì)胞。如血細(xì)胞等。6 貼壁細(xì)胞78 懸浮型細(xì)胞。9 半貼壁細(xì)胞10 （三）細(xì)胞貼壁過程11（四）細(xì)胞傳代后的四個(gè)生長階段潛伏期：細(xì)胞無分裂，6-24小時(shí)。指數(shù)生長期：細(xì)胞增殖最旺盛時(shí)期，分裂相細(xì)胞的比例（分裂指數(shù)）。停滯期：細(xì)胞數(shù)量達(dá)到飽和，細(xì)胞停止增殖，但仍有代謝活動(dòng)。平臺(tái)期。衰退期：自然衰退和耗竭衰退。12培養(yǎng)細(xì)胞一代生長過程13（五） 何時(shí)傳代與如何傳代？1. 肉眼觀察培養(yǎng)物顏色及混濁度142. 倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生

3、長狀態(tài)15 貼壁生長細(xì)胞傳代棄掉培養(yǎng)液，加0.51mL的胰酶涮洗一下培養(yǎng)瓶，去殘留的舊培養(yǎng)液，解除血清對(duì)胰酶的抑制作用。 每瓶細(xì)胞加入1mL胰酶, 蓋好瓶蓋后在倒置顯微鏡下觀察，當(dāng)細(xì)胞突起收回變圓時(shí)立即翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，使細(xì)胞脫離胰酶，然后將胰酶去掉。注意勿使細(xì)胞提早脫壁落入消化液中。加入5ml的含血清的新鮮培養(yǎng)基，反復(fù)吹打消化好的細(xì)胞使其脫壁并分散，制成細(xì)胞懸液計(jì)數(shù)然后分裝到新培養(yǎng)瓶中(1x105/ml ，5mL/小瓶） 。蓋上瓶蓋, 適度擰緊后再稍回轉(zhuǎn)，以利于CO2氣體的進(jìn)入，將培養(yǎng)瓶放回CO2培養(yǎng)箱。16 細(xì)胞消化的最佳程度17懸浮細(xì)胞傳代步驟可將細(xì)胞培養(yǎng)懸液進(jìn)行離心去除舊培養(yǎng)液上清，加入新鮮

4、培養(yǎng)液，然后分裝到各瓶中。18意義：為了保存細(xì)胞，特別是不易獲得的突變型細(xì)胞或細(xì)胞株，要將細(xì)胞凍存（保種）。運(yùn)送等條件：凍存的溫度一般用液氮的溫度196，短時(shí)間可以存放在-80 。凍存液：一般為含10%二甲亞砜（DMSO）或甘油的培養(yǎng)基(六)細(xì)胞凍存19 冷凍保護(hù)劑的種類及作用機(jī)制常用滲透性冷凍保護(hù)劑主要包括甘油、DMSO、乙二醇、丙二醇、乙酰胺、甲醇等。DMSO：對(duì)細(xì)胞無毒性，分子量小，溶解度好，能迅速透入細(xì)胞，降低冰點(diǎn)，提高細(xì)胞膜對(duì)水的通透性，延緩凍結(jié)過程，能使細(xì)胞內(nèi)水分在凍結(jié)之前透出細(xì)胞外，在胞外形成冰晶，提高細(xì)胞內(nèi)的電解質(zhì)濃度，減少胞內(nèi)冰晶，從而減少冰晶對(duì)細(xì)胞凍傷。常用濃度為5%-10

5、%，細(xì)胞在液氮中凍存1-2年，存活率可達(dá)80%-90%。DMSO液需預(yù)先用培養(yǎng)液配好，避免因臨時(shí)配制產(chǎn)熱而傷害細(xì)胞 20二、實(shí)驗(yàn)?zāi)康?掌握無菌操作技術(shù)。 掌握傳代細(xì)胞的培養(yǎng)的方法與步驟。 掌握培養(yǎng)細(xì)胞的消化方法。 了解在倒置相差顯微鏡下觀察培養(yǎng)細(xì)胞的形態(tài)和生長狀況。21三、實(shí)驗(yàn)材料及設(shè)備 1. 細(xì)胞 人宮頸癌HeLa 細(xì)胞 人胃癌BGC-823細(xì)胞 中國倉鼠卵巢CHO細(xì)胞2. 試劑 DMEM培養(yǎng)基、胰酶、血清、DMSO、抗生素 3. 儀器 超凈工作臺(tái)、CO2培養(yǎng)箱、倒置相差顯微鏡4.其它用品： 培養(yǎng)瓶，試管，移液管，巴斯德吸管，廢液缸，75酒精棉球，酒精燈 22四、實(shí)驗(yàn)步驟1.準(zhǔn)備：超凈工作臺(tái)

6、紫外線處理30分鐘, 用肥皂洗手, 穿鞋套，用新潔爾滅溶液拭擦雙手消毒。2. 倒置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，確定細(xì)胞是否需要傳代及細(xì)胞需要稀釋的倍數(shù)。將培養(yǎng)用液置37C預(yù)熱。3關(guān)閉超凈臺(tái)紫外燈, 打開可見光燈開關(guān),打開抽風(fēng)機(jī)清潔空氣，除去臭氧。用75%酒精擦雙手消毒 。 4.正確擺放超凈臺(tái)內(nèi)的實(shí)驗(yàn)用品：酒精燈、酒精棉球、新潔爾滅紗布、試管架、滴管筒（頭）、吸管筒（頭）、廢液缸等。點(diǎn)燃酒精燈，準(zhǔn)備好實(shí)驗(yàn)試劑：DMEM培養(yǎng)基（其中血清含量10%）、 血清、胰酶等。23245.點(diǎn)燃酒精燈；取出無菌試管，巴士德吸管和刻度吸管；安上橡皮頭；過酒精燈火焰略燒后插在無菌試管內(nèi)。6.將培養(yǎng)液瓶（90mL) 過酒精

7、燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。7. 打開血清瓶（10.5mL) ，瓶口過酒精燈火焰后斜置于酒精燈旁的架子上。8. 無菌吸取10mL血清加入到培養(yǎng)液（90mL)中，用微量移液器加入雙抗200L輕輕混勻，配置完全培養(yǎng)基。9. 在血清中（剩余0.5mL) 加入4mL完全培養(yǎng)基輕輕混勻，加入0.5mL DMSO（凍存保護(hù)劑），輕輕混勻即為凍存液 。252610.細(xì)胞瓶口靠近火焰打開瓶蓋并在酒精燈上燒口消毒，倒掉或吸出培養(yǎng)基（對(duì)于小口的培養(yǎng)瓶可采用傾倒方法,對(duì)于培養(yǎng)皿,必須用吸管吸出）11.加一滴管胰酶輕輕漂洗一下細(xì)胞，棄胰酶，再加入一滴管或兩滴管胰酶（以蓋住細(xì)胞量為準(zhǔn))，轉(zhuǎn)動(dòng)培養(yǎng)瓶，使其濕潤整個(gè)細(xì)胞

8、層，蓋好瓶蓋。12.顯微鏡下觀察細(xì)胞的消化狀態(tài)，待細(xì)胞大部分收縮、突起、變圓，細(xì)胞邊界清晰時(shí)，即可立起或翻轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶停止消化，在超凈臺(tái)內(nèi)靠近火焰處棄胰酶.2713. 加兩滴管（約1.8-2mL）凍存液既全面吹打細(xì)胞瓶壁,吹打均勻，細(xì)胞濃度宜大，3106個(gè)/mL左右。將細(xì)胞懸液吸至凍存管中，擰好蓋，封好膠布，并標(biāo)記好細(xì)胞種類，凍存時(shí)間，保存條件以及凍存者姓名等（懸浮細(xì)胞凍存將細(xì)胞離心后再加凍存液）在培養(yǎng)瓶(殘余少量細(xì)胞）中加入5mL完全培養(yǎng)基及，蓋好瓶蓋（擰緊后并旋回半圈）。做好記錄，倒置相差顯微鏡下觀察細(xì)胞的形態(tài)，放入CO2培養(yǎng)箱培養(yǎng)。凍存管在4度存放30min，轉(zhuǎn)放到20度 1.52h，再轉(zhuǎn)到70度412h后即可轉(zhuǎn)移到液氮內(nèi)，注意做好凍存記錄。28把握好傳代時(shí)機(jī)，80-90%匯合度階段最好，過早細(xì)胞產(chǎn)量少，過晚細(xì)胞健康狀態(tài)不佳消化時(shí)間要適度，過短細(xì)胞不易脫落，過長細(xì)胞可脫落流失。消化液濃度要適宜，過濃時(shí)消化作用強(qiáng)烈，細(xì)胞反應(yīng)快，所需消化時(shí)間短，掌握不好，細(xì)胞易流失。不