牙齦卟啉單胞菌誘導人白細胞脫顆粒的體外觀察

1、牙齦卟啉單胞菌誘導人白細胞脫顆粒的體外觀察【摘要】目的研究牙齦卟啉單胞菌及其可溶性毒力因子對人多形核白細胞的影響，討論其導致慢性牙周炎發(fā)生的作用機制。方法采集安康中老年人外周血，利用透射電鏡觀察多形核白細胞培養(yǎng)組對照組與牙齦卟啉單胞菌超聲粉碎濾液共同培養(yǎng)組實驗組多形核白細胞脫顆?，F(xiàn)象。結果實驗組多形核白細胞發(fā)生明顯的形態(tài)學變化，而對照組細胞無明顯變化；實驗組脫顆粒白細胞百分數(shù)較對照組顯著增多P0.001。結論牙齦卟啉單胞菌可誘導多形核白細胞中顆粒向細胞周邊挪動并脫出，從而降低宿主的免疫才能,在慢性牙周炎發(fā)生中具有重要作用?！娟P鍵詞】牙齦卟啉單胞菌；多形核白細胞；細胞脫顆粒慢性牙周炎在中老年人中

2、的患病率極高，是導致中老年人群牙齒缺失的主要原因。牙齦卟啉單胞菌Prphyrnasgingivalis，P.g是慢性牙周炎重要的可疑致病菌之一1，可通過其可溶性產物對牙周組織造成損傷，而多形核白細胞plyrphnulearleukytes，PNLs是機體抵抗病菌入侵的第一道防線2。在牙周炎發(fā)病過程中，宿主自身抵抗力的差異性是一個重要的因素，PNLs的功能正常與否，直接關系著機體免疫力的上下。研究發(fā)現(xiàn)：牙周致病菌與PNLs的互相作用在牙周病的致病機制中起重要作用3，4。目前針對P.g可溶性毒力因子對PNLs影響的系統(tǒng)研究較少，本研究旨在通過觀察P.g超聲濾液誘發(fā)PNLs脫顆粒的形態(tài)變化，討論P.

3、g可溶性毒力因子對PNLs的影響。1材料與方法1.1細菌菌種與研究對象P.g標準菌株AT33277購自上海市口腔醫(yī)學研究所。選擇10例安康老年人為試驗對象，男女各5例，平均年齡605歲，所有受試者均知情同意。受試者的選擇標準包括：無全身性疾?。唤?個月無服用抗生素類藥物；無活動性齲，牙周安康。1.2方法1.2.1細菌的培養(yǎng)及超聲濾液的制備將P.g接種在血液瓊脂培養(yǎng)基中營養(yǎng)瓊脂加10%新穎兔血，10%2的厭氧環(huán)境，37培養(yǎng)24h。將生長良好的細菌用生理鹽水洗下，配置成2單位麥氏比濁管的濃度6108FU/l，將該濃度的細菌置超聲儀中超聲粉碎PG115型超聲破碎儀，德國SE公司，取上清進展過濾，濾過

4、液置4保存?zhèn)溆谩?.2.2外周血PNLs的別離培養(yǎng)取10例安康老年人靜脈血20l，肝素抗凝后，用不連續(xù)密度梯度Perll別離PNLs。先將70%濃度Perll溶液緩慢參加試管中，再加50%濃度的Perll溶液，使之形成滿意的界面。加抗凝血約1.5l后離心25in，收取多形核細胞層，將細胞用不含血清的培養(yǎng)液洗滌2次，用含10%胎牛血清的RPI1640培養(yǎng)液制成細胞懸液5106/l，37，5%2孵箱中培養(yǎng)24h。1.2.3細菌超聲濾液作用于PNLs隨機分為兩組，實驗組在PNLs內參加P.g超聲粉碎濾液200l，對照組的PNLs內參加RPI1640培養(yǎng)液。在0、10、30和60in4個時間段進展電鏡

5、觀察。1.2.4透射電鏡樣品的制備1.3統(tǒng)計學分析用SPSS11.5統(tǒng)計軟件進展數(shù)據(jù)分析。采用成組設計兩樣本均數(shù)比擬t檢驗。轉貼于論文聯(lián)盟.ll.2結果2.1P.g超聲濾液誘發(fā)PNLs脫顆粒的形態(tài)變化電鏡觀察顯示：對照組中各時間點PNLs形態(tài)完好，細胞漿內無明顯顆粒，細胞膜邊緣整齊，細胞核呈分葉狀、飽滿圖1A。而實驗組中PNLs在P.g超聲濾液作用10in時，細胞內有明顯的顆粒聚集并向細胞周邊挪動的現(xiàn)象圖1B，在30和60in時，PNLs出現(xiàn)脫顆?，F(xiàn)象，同時伴有細胞不完好，細胞膜不光滑，細胞核皺縮的現(xiàn)象細胞凋亡出現(xiàn)，甚至出現(xiàn)細胞裂解死亡圖1、1D。2.2脫顆粒的PNLs與正常PNLs百分數(shù)的比

6、擬P.g的超聲濾液參加PNLs后在0、10、30、60in4個時間點利用電鏡觀察。結果顯示：在10、30和60in3個時間點變現(xiàn)出差異，實驗組在10in時脫顆粒的PNLs增多，在之后的時間里得到了持續(xù)，而對照組波動較實驗組穩(wěn)定。見表1。表1兩組脫顆粒的PNLs數(shù)略3討論老年人的牙周附著喪失重于年輕人，慢性牙周炎多見于中老年人。牙齦卟啉單胞菌是目前公認的牙周致病菌之一，也是牙周微生物領域重點研究的厭氧菌之一，與慢性牙周炎、侵襲性牙周炎、牙周膿腫和牙髓感染以及伴發(fā)性全身性系統(tǒng)疾病親密相關5，6。病原菌致病是一個多因素共同作用的過程，有參與根本生理過程的看家基因和多種毒力基因參與。P.g基因的多態(tài)性

7、與復雜性使得其致病機制迄今尚不明了，已發(fā)現(xiàn)的P.g的毒力因子包括菌毛、牙齦素、脂多糖LPS等7，8。PNLs是機體免疫防御系統(tǒng)的重要組成部分，既是白細胞中功能最活潑的多功能細胞，也是參與炎癥反響的主要細胞。PNLs具有吞噬作用，可以在感染組織中遷移,預防炎癥的擴散，是細胞免疫和體液免疫的積極參與者，主要通過釋放多種蛋白水解酶而發(fā)揮殺菌功能9。當PNLs不能正常行使其功能時，細菌不僅不會被殺死，而且可以抑制溶酶體和吞噬體的交融。即便是PNLs的吞噬才能正常，但對趨化性反響遲鈍，不能游走至趨化因子刺激的部位，會使感染經久不愈。PNLs的殺菌作用主要依賴于吞噬溶酶體中顆粒成分所調節(jié)的非氧化機制。顆粒

8、成分的細胞外釋放可能抵消PNLs內殺傷作用，降低部分的免疫防御功能和屏障作用。導致溶酶體成分細胞外分泌的主動過程為細胞支架的聚合，它是顆粒向細胞周邊的轉運機制9。此外，脫顆粒將導致牙周組織內溶酶體混合成分濃度的增加，它不僅有害于宿主細胞，而且還可以參與牙周組織的病理過程加劇炎癥反響10。將P.g用超聲波粉碎機粉碎，濾液內會含有該菌的絕大部分可溶性毒力因子。研究這種濾液既可以防止菌體本身的不確定性又能防止單一成分的不完好性，是一種方便、可靠的有效途徑4。本實驗將P.g超聲粉碎濾液與安康中老年人外周血中的PNLs共同培養(yǎng),結果發(fā)現(xiàn)：實驗組(在PNLs中參加P.g超聲粉碎濾液)和對照組(在含抗毒血清的PNLs中參加P.g超聲粉碎濾液)存在顯著差異，實驗組脫粒的PNLs百分數(shù)明顯高于對照組，同時隨時間的延長，脫顆?，F(xiàn)象更加明顯。本研究認為，P.g的超聲粉碎濾液可以使安康中老年人外周血中的PNLs發(fā)生脫顆粒，從而通過降低宿主的免疫功能導致牙周