絕對(duì)定量和相對(duì)定量

1、絕對(duì)定量和相對(duì)定量第1頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二提綱：實(shí)時(shí)熒光定量PCR原理 數(shù)學(xué)原理 化學(xué)原理實(shí)時(shí)熒光定量PCR的方法應(yīng)用 絕對(duì)定量 相對(duì)定量定量PCR的實(shí)驗(yàn)要素平臺(tái)定量PCR儀器介紹第2頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二實(shí)時(shí)熒光定量PCR定義： 在PCR反應(yīng)體系中加入熒光基團(tuán)，利用熒光信號(hào)累積實(shí)現(xiàn)了實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)整個(gè)PCR進(jìn)程，對(duì)起始模板進(jìn)行定量分析的方法。第3頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二與普通PCR的區(qū)別普通PCR技術(shù)： 在PCR結(jié)束后對(duì)終點(diǎn)產(chǎn)物進(jìn)行定量分析。實(shí)時(shí)定量PCR技術(shù)：實(shí)時(shí)檢測(cè)PCR擴(kuò)增，在擴(kuò)增的指

2、數(shù)期對(duì)起始模板進(jìn)行定量。第4頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二第5頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二第6頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二第7頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二熒光閾值是在熒光擴(kuò)增曲線上人為設(shè)定的一個(gè)值，它可以設(shè)定在熒光信號(hào)指數(shù)擴(kuò)增階段任意位置上，一般熒光域值的設(shè)置是 基線（背景）熒光信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏差的 10 倍。每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的域值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)數(shù)被稱為 CT 值（ threshold value ）。 第8頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二第

3、9頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二定量PCR的數(shù)學(xué)原理第10頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二第11頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二斜率與擴(kuò)增效率第12頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二第13頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二熒光定量PCR化學(xué)原理 非特異性熒光標(biāo)記： 1、SYBR Green 特異性熒光標(biāo)記： 2、TaqMan第14頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二1、SYBR Green 法第15頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46

4、分，星期二SYBR Green 熔解曲線分析第16頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二SYBR Green法優(yōu)缺點(diǎn)優(yōu)點(diǎn):對(duì)DNA模板沒有選擇性適用于任何DNA使用方便-不必設(shè)計(jì)復(fù)雜探針非常靈敏便宜第17頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二2、TaqMan探針法第18頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二TaqMan作用機(jī)理第19頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二TaqMan法優(yōu)缺點(diǎn)第20頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二 Real-time PCR 方法應(yīng)用第21頁(yè)，共38頁(yè)，202

5、2年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二絕對(duì)定量(Absolute Quantification，AQ) 病原體檢測(cè) 轉(zhuǎn)基因食品檢測(cè) 基因表達(dá)研究相對(duì)定量(Relative Quantification，RQ) 基因在不同組織中的表達(dá)差異 藥物療效考核 耐藥性研究第22頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二絕對(duì)定量與相對(duì)定量的定義第23頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二絕對(duì)定量通過標(biāo)準(zhǔn)品定量絕對(duì)定量的標(biāo)準(zhǔn)樣品： 已知拷貝數(shù)的質(zhì)粒DNA，做系列稀釋。標(biāo)準(zhǔn)樣品的種類：含有和待測(cè)樣品相同擴(kuò)增片段的克隆質(zhì)粒含有和待測(cè)樣品相同擴(kuò)增片段的cDNAPCR的產(chǎn)物第24

6、頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二絕對(duì)定量：從熒光到拷貝數(shù)第25頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二相對(duì)定量通過內(nèi)標(biāo)定量?jī)?nèi)標(biāo)（Endogenous Control）通常是-actin、GAPDH基因等看家基因在細(xì)胞中的表達(dá)量或在基因組中的拷貝數(shù)恒定，受環(huán)境因素影響小內(nèi)標(biāo)定量結(jié)果代表了樣本中所含細(xì)胞或基因組數(shù)量第26頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二相對(duì)定量：參照因子Calibrator 第27頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二相對(duì)定量分析方法1 -Ct前提：目標(biāo)序列和內(nèi)參序列的擴(kuò)增效率接近100且偏

7、差在 5以內(nèi) 1、用內(nèi)參基因的CT值歸一目標(biāo)基因的CT值： CT（test)= CT （target,test) - CT （ref,test) CT（calibrator)= CT （target, calibrator) - CT （ref, calibrator) 2、用校準(zhǔn)樣本的CT值歸一試驗(yàn)樣本的CT值： CT= CT（test) - CT（calibrator) 3、計(jì)算表達(dá)水平比率： 2 CT=表達(dá)量的比值第28頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二相對(duì)定量分析方法2：雙標(biāo)準(zhǔn)曲線法目標(biāo)基因與內(nèi)參基因擴(kuò)增效率不同 待測(cè)樣品目的基因濃度 待測(cè)樣品內(nèi)參基因濃度 F=

8、 對(duì)照樣品目的基因濃度 對(duì)照樣品內(nèi)參基因濃度第29頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二 定量PCR的實(shí)驗(yàn)要素第30頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二樣品DNA純度：OD260/OD280=1.8，1.6 2.0之間DNA用量：0.05 ng 100 ngRNA純度：OD260/OD280=2.0 cDNA用量：1-100 ng 總RNA反轉(zhuǎn)錄的cDNA取1 uL第31頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二標(biāo)準(zhǔn)品第32頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二標(biāo)準(zhǔn)品梯度稀釋方法第33頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二復(fù)管測(cè)試樣品和標(biāo)準(zhǔn)品都要重復(fù)重復(fù)次數(shù)須遵循統(tǒng)計(jì)學(xué)要求第34頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星期二平臺(tái)PCR儀介紹ABI 7500 fast第35頁(yè)，共38頁(yè)，2022年，5月20日，19點(diǎn)46分，星