大鼠肝移植急排模型的建立及相關(guān)免疫指標的檢測

1、大鼠肝移植急排模型的建立及相關(guān)免疫指標的檢測【摘要】目的：建立同種異體大鼠原位肝移植動物模型，觀察急性排擠反響的發(fā)生開展以及相關(guān)免疫指標的變化過程。方法：Leis大鼠與BN大鼠隨機分為3組：正常對照組、同基因移植組及同種異基因移植組。觀察大鼠存活率，移植組受體分別于術(shù)后3、5、7和10d處死取標本，觀察肝臟組織病理和超微構(gòu)造變化，全自動生化分析法測定血清谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT、總膽紅素ttalbilirubin，TBIL和白蛋白albuin，Alb程度變化，ELISA檢測血清IL-2含量。結(jié)果：在未用任何免疫抑制劑情況下，同基因組大鼠無急性排擠表現(xiàn)，14d生存率為100%，肝組織發(fā)生輕度形態(tài)學改變，

2、肝功能損害較輕，血清IL-2在正常范圍。異基因組大鼠14d內(nèi)全部死亡，術(shù)后第7天肝組織病理改變出現(xiàn)典型急性排擠反響表現(xiàn)，肝臟功能損害較重，血清IL-2持續(xù)性升高，并在第7天達峰值。結(jié)論：Leis大鼠與BN大鼠的組合方式，可以建立穩(wěn)定的急排模型急性排擠反響模型，在未用任何免疫抑制劑情況下，大鼠術(shù)后第7天急性排擠反響指標表現(xiàn)最為典型。【關(guān)鍵詞】肝移植急性排擠反響白細胞介素2大鼠【ABSTRAT】bjetive:Testablishtheauterejetindelfrthtpilivertransplantatininrat(RLT)andbservethebasipathphysilgihang

3、esfauterejetin.ethds:Theratsererandlydividedintthreegrups:ntrlgrup,istransplantatingrup(LE-LE),andalltransplantatingrup(LE-BN).Reipientseresarifiedn3,5,7,and10dayspstperativelyandlivertissuesandbldsapleserelleted.Reipientsurvivalrate,histpathlgialandultrastruturalharateristiserebserved.ALT,TBIL,andA

4、lbereeasuredithautatibiheialanalyser.IL-2ntentinseruasassayedbyELISA.Results:ThereasnrejetininistransplantatinfrLeistLeisratresultedand14-daysurvivalratereahed100%.TheIL-2nentratininseruasatnrallevel.nthentrary,allreipientsinalltransplantatingrupfrLEtBNratdiedang14dayspstperatively,andhepatihistlgia

5、lexainatinshedtypialauterejetinn7days.Liverfuntinasseverelyipaired,hihasindiatedbysignifiantinreasefALTandTBILlevelsandapparentdereasefAlblevel.TheIL-2nentratininseruasntinuuslyinreasedandreaheditspeakvaluen7dayspstperatively.nlusin:Anauterejetinexperientaldelflivertransplantatininratuldbestablyesta

6、blishedusingLeisratasdnrandBNratasreipient.【KEYRDS】LivertransplantatinAuterejetinInterleukin-2Rat自1963年Starzl施行世界上第一例人體肝移植以來，歷經(jīng)近半個世紀開展，肝移植已成為治療終末期肝病的有效手段，但目前仍有許多問題亟待解決，例如排擠反響、器官保存、供肝短缺等1-3。動物器官移植實驗研究為解決上述問題提供了有效手段，由于大動物的基因型不易確定，且純系大動物不易獲得，以大鼠為代表的小動物移植模型在器官移植領(lǐng)域占有舉足輕重的地位4-5。本研究以純系雄性LeisRt1l、BNRt1n大鼠建立

7、大鼠肝移植急性排擠反響auterejetin模型以下簡稱急排模型，同時檢測排擠相關(guān)病理生理指標、細胞因子的變化情況，為說明大鼠肝移植急性排擠反響的發(fā)生開展過程提供了可靠的實驗根據(jù)。1材料與方法1.1實驗動物及分組純系雄性LeisRt1l大鼠50只和BNRt1n大鼠14只，10周齡，體質(zhì)量220250g，由北京維通利華實驗動物提供。隨機分為3組，1對照組n=8：取正常Leis大鼠為實驗對照；2同基因移植組n=28：供受體各14只均采用Leis大鼠；3同種異基因移植組n=28：Leis大鼠14只為供體，BN大鼠14只為受體。移植組受體大鼠分別于術(shù)后3、5、7和10d各處死2只，搜集肝臟組織和血清作

8、相應檢測，剩余6只大鼠用于觀察存活時間。1.2方法1.2.1大鼠原位肝移植模型的建立參照Peng等6介紹的改進Kaada袖套法，建立大鼠原位肝移植動物模型。1.2.2肝臟組織病理觀察取右肝前葉肝組織放入10%中性甲醛中固定2448h，常規(guī)脫水、透明、石蠟包埋、5厚切片，HE染色，光學顯微鏡觀察。根據(jù)illias等7推薦標準對急性免疫排擠反響進展病理分級。取右肝前葉肝組織立即切成約111大小放入2%的戊二醛固定48h，再用1%四氯化鋨后固定1.5h，梯度丙酮脫水，環(huán)氧樹脂包理，1厚超薄切片，H-2000透射電子顯微鏡觀察。1.2.3肝功能檢測取外周血12L，3000r/離心10in，取上層血清用

9、全自動生化分析儀測定2組大鼠肝移植后各時相點血漿中谷丙轉(zhuǎn)氨酶ALT、總膽紅素ttalbilirubin，TBIL和白蛋白albuin，Alb程度變化。1.2.4血清中細胞因子IL-2檢測采用IL-2ELISA檢測試劑盒Siga，美國對血清中IL-2含量進展檢測，詳細方法參照試劑盒說明書。1.3統(tǒng)計學處理采用SPSS10.0統(tǒng)計軟件包進展分析，所有數(shù)據(jù)以xs表示，單因素方差分析，組間生存率比擬采用2檢驗。P0.05為差異有統(tǒng)計學意義。2結(jié)果2.1大鼠術(shù)后存活情況在未用任何免疫抑制劑情況下，2組承受肝移植的大鼠在術(shù)后2d內(nèi)全部存活，且生存質(zhì)量無明顯差異。術(shù)后第3天，逐漸顯出差異，同基因組大鼠飲食、

10、精神狀況逐漸恢復，而異基因組大鼠食欲不佳、精神萎靡；術(shù)后第5天，2組的差異比擬明顯，同基因組大鼠一般狀況已根本恢復正常，異基因組耳、尾部出現(xiàn)黃染，很少活動；術(shù)后第7天，2組差異更為明顯，同基因組大鼠生活正常，而異基因組出現(xiàn)明顯腹水、黃疸進展性加重，開場死亡。術(shù)后第14天，同基因組6只大鼠全部存活存活率100%，異基因組大鼠全部死亡存活率0%，6只大鼠存活時間分別為7、8、9、11、12、13d，2組比擬差異有統(tǒng)計學意義P0.01。2.2肝臟組織病理改變在移植術(shù)后的35d內(nèi)，同基因組未出現(xiàn)免疫排擠反響的病理損害illias0級，僅出現(xiàn)輕度的缺血再灌注損傷isheia-reperfusininru

11、ry,IRI，在術(shù)后第7天，肝臟病理表現(xiàn)根本恢復正常；而異基因組術(shù)后第3天即表現(xiàn)出輕度急性排擠反響改變(illias1級1例)，第5天明顯加重illias1、2級各1例，第7天病理變化最為典型，均到達illias3級，第10天無明顯變化。2.2.1光學顯微鏡觀察同基因組肝臟組織構(gòu)造僅有輕度IRI表現(xiàn)，肝細胞輕度變性濁腫，肝血竇輕度擴張、充血；匯管區(qū)有較少炎性細胞浸潤；膽管上皮細胞構(gòu)造正常，整個肝小葉構(gòu)造根本正常。異基因組肝細胞變性重，有較多壞死肝細胞；肝血竇顯著擴張充血，匯管區(qū)及中央靜脈周圍出現(xiàn)以淋巴細胞為主的炎性細胞浸潤；膽管上皮細胞胞質(zhì)空泡變性，核固縮，最終匯管區(qū)僅剩膽管的剩余或膽管完全消

12、失；整個肝小葉構(gòu)造混亂。2.2.2電子顯微鏡觀察同基因組大鼠肝細胞超微構(gòu)造無明顯異常，僅有部分肝細胞胞質(zhì)線粒體輕度腫脹，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)擴張；毛細膽管線粒體輕度腫脹，微絨毛根本正常；肝血竇輕度擴張，內(nèi)皮細胞輕度腫脹，巨噬細胞少見，體積校異基因組肝細胞空泡變性明顯，線粒體明顯腫脹甚至空化；毛細膽管擴張，膽管上皮細胞腫脹，微絨毛脫落；肝血竇內(nèi)皮細胞腫脹明顯，線粒體腫脹或空化，巨噬細胞數(shù)量明顯增多、體積明顯增大、吞噬活潑。2.2.3肝功能變化同基因移植組大鼠術(shù)后第3天ALT明顯增高，TBIL、Alb在正常范圍之內(nèi)，第5天以后以上肝功能指標均恢復至正常程度；而異基因組大鼠術(shù)后第3天即出現(xiàn)明顯肝功能改變，主要表現(xiàn)

13、為ALT、TBIL升高，Alb降低，第5天指標進一步惡化，第7天改變尤為明顯，與同基因組相比，差異均有統(tǒng)計學意義P0.01，圖1。2.3血清中IL-2程度同基因移植組大鼠術(shù)后第3、5天血清中IL-2較正常程度稍有升高，第7天后恢復至正常范圍之內(nèi)；而異基因組大鼠從術(shù)后第3天開場出現(xiàn)IL-2持續(xù)性升高，并在第7天達峰值，與同基因組相比，差異有統(tǒng)計學意義P0.01，圖2。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3討論目前在大鼠器官移植實驗研究中，主要有以下幾種組合方式可以導致排擠反響模型：DALERT1avsRT1l，DAAUGRT1avsRT1，LEAUGRT1lvsRT1，以及LEBNRT1lvsRT1n8。其中

14、Leis大鼠與BN大鼠在主要組織相容性復合物ajrhistpatibilityplex,H以及次要組織相容性復合物inrhistpatibilityplex,H方面均不一樣，二者的組合方式是中等強度的排擠模型，已經(jīng)被廣泛應用于大鼠器官移植急性排擠實驗研究中。Suzuki等9用LeisBN成功建立大鼠腎移植急排模型，受體術(shù)后第7天血清尿素氮和N升高達峰值，伴隨著腎臟組織重度急性排擠病理表現(xiàn)；Lee等10報道，LeisBN可以建立大鼠異位小腸移植急排模型，排擠組小腸組織細胞大量發(fā)生凋亡；Deuse等11也應用LeisBN的組合建立了大鼠心臟移植急排模型。本研究以Leis為供體，BN為受體，建立了大

15、鼠肝移植急排模型，并觀察了急性排擠反響的開展及根本病理生理指標變化過程。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在未用任何免疫抑制劑情況下，受體術(shù)后第3天即出現(xiàn)食欲不佳、精神萎靡，術(shù)后第5天出現(xiàn)部分黃染，術(shù)后第7天黃疸進展性加重，并出現(xiàn)明顯腹水和死亡，術(shù)后第14天，大鼠全部死亡12。與同基因移植組相比，差異有統(tǒng)計學意義P0.01。肝臟的病理組織學改變提示，異基因組術(shù)后第3天即表現(xiàn)出急性排擠反響改變，第5天明顯加重，第7天病理變化最為典型，均到達illias3級，光學顯微鏡下肝細胞變性重，伴大量肝細胞壞死，血竇擴張充血，內(nèi)皮細胞腫脹明顯，匯管區(qū)及中央靜脈出現(xiàn)以淋巴細胞為主的炎性細胞浸潤，膽小管破壞伴炎性細胞浸潤，整個肝小葉構(gòu)

16、造混亂。電子顯微鏡下，竇內(nèi)皮細胞腫脹明顯，線粒體腫脹或空化，巨噬細胞數(shù)量明顯增多，其體積明顯增大，吞噬活潑，提示巨噬細胞呈明顯活化狀態(tài)。肝功能檢測結(jié)果發(fā)現(xiàn)，異基因移植大鼠術(shù)后第3天即出現(xiàn)明顯肝功能改變，ALT、TBIL，Alb降低，第5天指標進一步惡化，第7天改變尤為明顯，與同基因組相比，P0.01見圖4。血清中的IL-2術(shù)后持續(xù)性升高，并在第7天達峰值P0.01。這與Ninva等13的研究結(jié)果根本相似，在用LeisBN組合的大鼠肝移植研究中，未用抗D8抗體的對照組中，受體術(shù)后第6天血清AST升高達峰值542IU/L，第9天肝臟病理顯示重度急性排擠。綜上所述，以Leis大鼠為供體，BN大鼠為受

17、體的大鼠肝移植模型是研究急性排擠反響的理想模型，具有很好的穩(wěn)定性。根據(jù)肝臟組織病理、肝功能以及血清細胞因子變化過程，可以發(fā)現(xiàn)大鼠肝移植急性排擠反響出如今術(shù)后第3天，術(shù)后第7天各種指標改變最為典型?！緟⒖嘉墨I】1Uribe,GnzlezG,AlbaA,etal.Livingdnrlivertransplantatininpediatripatientsithauteliverfailure:safeandeffetivealternativeJ.TransplantPr,2022,409:3253-3255.2VlkL,LkAS,PelletierSJ,etal.Ipatfthedelfrend

18、-stageliverdiseaseallatinpliyntheusefhigh-riskrgansfrlivertransplantatinJ.Gastrenterlgy,2022,1355:1568-1574.3PerkinsJD.PreditingstinlivertransplantatinJ.LiverTranspl,2022,1411:1676-1677.4iyagiS,kadaA,ikaaK,etal.EffetsfserineprteaseinhibitrandprstaglandinI2nlivertransplantatinfrnn-heart-beatingratdnr

19、sJ.TransplantPr,2022,407:2152-2155.5henY,LiuZ,LiangS,etal.RlefKupfferellsintheindutinftleranefrthtpilivertransplantatininratsJ.LiverTranspl,2022,146:823-836.6PengY,GngJP,LiuA,etal.Expressinftll-likereeptr4andD-2geneandprtEininkupfferellsafterisheia-reperfusininratlivergraftJ.rldJGastrenterl,2022,1019:2890-2893.7illiasJ,PetersTG,VeraSR,etal.Bipsy-diretediunsuppressinfllinghepatitransplantatininanJ.Transplantatin,1985,396:589-596.8BukleyRH.Transplantatiniunlgy:rganandbnea