細胞工程第四章細胞培養(yǎng)課件

1、細胞工程-第四章細胞培養(yǎng)10112022/9/25細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011細胞工程-第四章細胞培養(yǎng)10112022/9/24細胞工程第本章主要內(nèi)容：培養(yǎng)細胞的生物學(xué)特性常用培養(yǎng)液的組成和配制細胞培養(yǎng)的基本方法細胞系和細胞株的建立細胞凍存復(fù)蘇等細胞培養(yǎng)的技術(shù)第四章 細胞培養(yǎng)細胞工程第四章細胞培養(yǎng)10112本章主要內(nèi)容：第四章 細胞培養(yǎng)細胞工程第四章細胞培養(yǎng)10114.1 培養(yǎng)細胞的生物學(xué)特征細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101134.1 培養(yǎng)細胞的生物學(xué)特征細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101134.1.1 體外培養(yǎng)細胞的分型 1. 貼附型：大多數(shù)培養(yǎng)細胞貼附生長，屬于貼壁依賴性細胞，判斷細胞形態(tài)時不能按

2、照體內(nèi)組織學(xué)標(biāo)推判定，僅大致分成以下四型：上皮細胞型成纖維細胞型游走細胞型多形型細胞2. 懸浮型：見于少數(shù)特殊的細胞，如某些類型的癌細胞及白血病細胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細胞容易大量繁殖。 細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101144.1.1 體外培養(yǎng)細胞的分型 1. 貼附型：大多數(shù)培養(yǎng)細胞 細胞呈扁平不規(guī)則多角形，中央有圓形核，細胞彼此緊密相連成單層膜。生長時呈膜狀移動，處于膜邊緣的細胞總與膜相連，很少單獨行動。起源于內(nèi)、外胚層的細胞如皮膚表皮及其衍生物、消化管上皮、肝胰、肺泡上皮等皆成上皮型形態(tài)。 上皮細胞型：乳腺癌細胞細胞工程第四章細胞培養(yǎng)10115 細胞呈扁平不規(guī)則多角形，

3、中央有圓形核，細胞彼此緊密相 胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，生長時呈放射狀。除真正的成纖維細胞外，凡由中胚層間充質(zhì)起源的組織，如心肌、平滑肌、成骨細胞、血管內(nèi)皮等常呈本型狀態(tài)。另外，凡培養(yǎng)中細胞的形態(tài)與成纖維類似時皆可稱之為成纖維細胞。 成纖維細胞型：細胞工程第四章細胞培養(yǎng)10116 胞體呈梭型或不規(guī)則三角形，中央有卵圓形核，胞質(zhì)突起，游走細胞型：呈散在生長，一般不連成片，胞質(zhì)常突起，呈活躍游走或變形運動，方向不規(guī)則。此型細胞不穩(wěn)定，有時難以和其他細胞相區(qū)別。單核細胞、巨噬細胞等。細胞工程第四章細胞培養(yǎng)10117細胞工程第四章細胞培養(yǎng)10117多型細胞型： 有一些細胞，如

4、神經(jīng)細胞難以確定其規(guī)律和穩(wěn)定的形態(tài)，可統(tǒng)歸于此類。神經(jīng)元神經(jīng)膠質(zhì)細胞。 細胞工程第四章細胞培養(yǎng)10118多型細胞型：細胞工程第四章細胞培養(yǎng)10118細胞工程第四章細胞培養(yǎng)10119細胞工程第四章細胞培養(yǎng)10119 見于少數(shù)特殊的細胞，如某些類型的癌細胞及白血病細胞。胞體圓形，不貼于支持物上，呈懸浮生長。這類細胞容易大量繁殖。 2. 懸浮型概念：培養(yǎng)時不貼附于底物而呈懸浮狀態(tài)生長 或以機械方法使保持懸浮狀態(tài)下生長來源：自血，脾或骨髓，尤以血中白細胞癌腫細胞也可能特點：在懸浮中生長良好細胞圓形，單個或小細胞團優(yōu)點：生存空間大，提供數(shù)量大，傳代方便(不需消化)， 易于收獲，可獲得穩(wěn)定狀態(tài)缺點：觀察不

5、方便，很多細胞不能懸浮生長(尤以正常細胞)細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101110 見于少數(shù)特殊的細胞，如某些類型的癌細胞及白血病細胞。4.1.2 培養(yǎng)細胞的生長特點 1.貼附貼附并伸展是貼壁細胞體外培養(yǎng)時的基本生長特點。細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011114.1.2 培養(yǎng)細胞的生長特點 1.貼附細胞工程第四章細胞培 體外培養(yǎng)的小鼠子宮上皮細胞(a) 消化分離得到的細胞團塊； (b) 生長至第3天的細胞單層； (c) 生長至第4天的細胞單層； (d) 生長至第6天的細胞單層細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101112 4.1.2 培養(yǎng)細胞的生長特點 2.接觸抑制 接觸抑制是體外培養(yǎng)中某些貼附型細胞生長特性之一。

6、一般情況下，正常細胞不停頓的活動或移動，其外周的細胞膜呈現(xiàn)一些特征性皺褶樣活動。但是，當(dāng)兩個細胞由于移動而相互靠近發(fā)生接觸時，細胞不再移動，在接觸區(qū)域的細胞膜皺褶樣活動停止，從而使細胞停止運動。這種由細胞接觸而抑制細胞運動的現(xiàn)象稱為接觸抑制。 細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011134.1.2 培養(yǎng)細胞的生長特點 2.接觸抑制細胞工程第四章細4.1.2 培養(yǎng)細胞的生長特點 2.接觸抑制 由于細胞之間有接觸抑制生長特性，一般正常生長細胞并不互相重疊于其上而生長，而是呈單層生長。但是腫瘤細胞由于無接觸抑制而能夠繼續(xù)移動和增殖，導(dǎo)致細胞向三維空間擴展，使細胞發(fā)生堆積。因此，（接觸抑制）可作為區(qū)分正常細胞與

7、癌細胞的標(biāo)志之一。細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011144.1.2 培養(yǎng)細胞的生長特點 2.接觸抑制細胞工程第四章細4.1.2 培養(yǎng)細胞的生長特點 3.密度抑制 細胞接觸匯合后，雖發(fā)生接觸抑制，但只要營養(yǎng)充分，細胞仍然能夠進行增殖分裂，數(shù)量仍然增多。但當(dāng)細胞密度進一步增大，培養(yǎng)液中營養(yǎng)成分減少，代謝產(chǎn)物增多時，細胞因營養(yǎng)的枯竭和代謝物的影響，則發(fā)生密度抑制，導(dǎo)致細胞分裂停止。細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011154.1.2 培養(yǎng)細胞的生長特點 3.密度抑制細胞工程第四章細4.1.3 培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程 細胞系的生長過程分為：原代培養(yǎng)期、傳代期和衰退期。細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011164.1.3

8、 培養(yǎng)細胞的生長和增殖過程 細胞系的生長過程細胞工 細胞系的生長過程原代培養(yǎng)期傳代期衰退期為新鮮組織自體內(nèi)取出并在體外培養(yǎng)生長至第一次傳代的時期。原代培養(yǎng)的細胞生長一定時間之后，如貼附型細胞即融合成片而逐漸鋪滿底物的表面，此時，便應(yīng)將原代細胞分開接種至2個或更多的新的培養(yǎng)器皿中，即傳代，此即成細胞系。一般有限細胞系在此期的細胞開始時雖仍然存活，但增殖已很緩慢并逐漸完全停止，進而細胞發(fā)生衰退死亡。細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101117 細胞系的生長過程原代培養(yǎng)期傳代期衰退期為新鮮組織自體內(nèi)取每代細胞的生長過程 所謂細胞“一代”一詞，僅指從細胞接種到分離再培養(yǎng)時的一段時間，這已成為培養(yǎng)工作中的一種習(xí)慣

9、說法，它與細胞倍增一代非同一含義。如某一細胞系為第153代細胞，即指該細胞系已傳代153次。它與細胞世代（Generation）或倍增( Doubling）不同；在細胞一代中，細胞能倍增36次。細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101118細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011183. 組織培養(yǎng)細胞一代生存期細胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下三個階段： 潛伏期（Latent Phase）; 指數(shù)生長期（Logarithmic growth Phase）; 停止期/平臺期（Stagnate Phase）.細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011193. 組織培養(yǎng)細胞一代生存期細胞傳一代后，一般要經(jīng)過以下三個理想的實驗用細胞細胞工程

10、第四章細胞培養(yǎng)101120理想的實驗用細胞細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011204.1.5 體內(nèi)外細胞的差異和分化細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011214.1.5 體內(nèi)外細胞的差異和分化細胞工程第四章細胞培養(yǎng)10(1) 主要表現(xiàn) 失去原有組織結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài) 可能出現(xiàn)脫分化或去分化 細胞趨向單一化；4.1.5 體內(nèi)外細胞的差異和分化細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101122(1) 主要表現(xiàn) 失去原有組織結(jié)構(gòu)和細胞形態(tài) 可能（2）與體內(nèi)主要不同點 相對孤立、相對單一 缺乏體內(nèi)的系統(tǒng)作用、失去神經(jīng)體液的調(diào)節(jié)和細胞相互間的影響 (3) 提示 要正確認(rèn)識體外培養(yǎng)細胞 是一種特定條件下生長的細胞群體。細胞工程第四章細胞培

11、養(yǎng)101123（2）與體內(nèi)主要不同點 相對孤立、相對單一 缺乏體內(nèi)4.2 細 胞 培 養(yǎng) 液細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011244.2 細 胞 培 養(yǎng) 液細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101124.2.1 細 胞 的 常 用 液 體細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011254.2.1 細 胞 的 常 用 液 體細胞工程第四章細胞培養(yǎng)水：新鮮配置的三蒸水或超純水2.平衡鹽溶液(balanced salt solution，BSS)又稱生理鹽水或鹽溶液，是細胞培養(yǎng)中常用的基本液體。它主要由無機鹽和葡萄糖配制而成，起著維持滲透壓、緩沖和調(diào)節(jié)酸堿度等重要作用。常用的緩沖液：生理鹽水、PBS、PBS(注意有無鈣鎂離子)、

12、 Hanks液（含有鈣鎂離子、葡萄糖、酚紅）配液時注意：（1）用水；配制先后順序；稱量，要看清藥品的規(guī)格、純度、結(jié)晶水的數(shù)量等。（2）物質(zhì)的純度，常用的純度有優(yōu)級純(特級純)，分析純（AR）和化學(xué)純（CD）三種。（3）物質(zhì)的可溶性，避免沉淀析出。（4）物質(zhì)的穩(wěn)定性，如葡萄糖只能在10磅下維持1520分鐘。（5）貯存液 通常先配制成10倍或100倍的一系列母液，用前臨時混合和稀釋，過濾除菌備用。細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101126水：新鮮配置的三蒸水或超純水細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101123膠原酶0.25%細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011273膠原酶0.25%細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011274.

13、pH調(diào)節(jié)液(1)碳酸氫鈉液 可根據(jù)需要與使用方便配制10%以下的各種濃度。先用雙蒸水溶解后，需經(jīng)過濾除菌，分裝小瓶中。亦可使用高壓蒸氣滅菌，密封，4冰箱保存。市售有5%10%濃度的安瓿封裝品，使用也很方便。在調(diào)節(jié)pH過程中或超過要求值時，可用高壓滅菌的10%醋酸溶液或以CO2調(diào)節(jié)之。(2)Hepes緩沖液 是一種可以保持細胞培養(yǎng)過程中pH值較長時間穩(wěn)定的氫離子緩沖劑。通常使用濃度為1015mmol/L。配制時，稱取所需的Hepes量，用培養(yǎng)液溶解，用1mmol/LNaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，過濾除菌分裝小瓶中，4冰箱保存。細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011284. pH調(diào)節(jié)液細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1

14、011285 抗生素溶液(PS)為防止細胞培養(yǎng)過程中發(fā)生污染，一般在培養(yǎng)液中加入青霉素鈉鹽和硫酸鏈霉素，其濃度分別為每毫升含100U和100g 。配制時取青霉素1106和鏈霉素1106g,溶于100ml Hanks或PBS中，使其含量為青霉素1104U/ml，鏈霉素1104g/ml，使用時每100ml培養(yǎng)液中加入0.5-1ml。細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011295 抗生素溶液(PS)細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011296.細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011306.細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011307.細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011317.細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011314.2.2 細 胞 培 養(yǎng)

15、基細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011324.2.2 細 胞 培 養(yǎng) 基細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101營 養(yǎng) 需 要基本營養(yǎng)物質(zhì)：包括氨基酸、維生素、碳 水化合物及一些無機離子。促生長因子：體外培養(yǎng)細胞既需要上述基本營養(yǎng) 物質(zhì)，還需要促細胞生長因子等物 質(zhì)才能正常生長、繁殖。血清中含 有多種這類物質(zhì)，有利于多數(shù)細胞的存活和生長。RPMI-1640培養(yǎng)液1020%FBS細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101133營 養(yǎng) 需 要基本營養(yǎng)物質(zhì)：包括氨基酸、維生素、碳促生長因子4.2.1細胞培養(yǎng)基細胞培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細胞生存和生長的溶液分為天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011344

16、.2.1細胞培養(yǎng)基細胞培養(yǎng)基組成培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外1.培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細胞生存和生長的溶液，分天然培養(yǎng)基和合成培養(yǎng)基。天然培養(yǎng)基：天然培養(yǎng)基有血清、血漿、和組織提取液（如雞胚和牛胚浸液）。優(yōu)點：營養(yǎng)成分豐富，培養(yǎng)效果好。缺點：來源受限。成分復(fù)雜，影響對某些實驗產(chǎn)物的提取和實驗結(jié)果的分析。易發(fā)生支原體污染。 細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011351.培養(yǎng)基培養(yǎng)基（培養(yǎng)液）是維持體外細胞生存和生長的溶液，分合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人工方法模擬合成的。目前已設(shè)計出許多種培養(yǎng)基，如TC199、MEM、RPMI-1640、DMEM等。合成培養(yǎng)基主要成

17、分是氨基酸、維生素、碳水化合物、無機鹽和其它一些輔助物質(zhì)。 優(yōu)點：標(biāo)準(zhǔn)化生產(chǎn)，組分和含量相對固定。成本低 。 缺點：缺少某些成分，不能完全滿足體外細胞生長需要。細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101136合成培養(yǎng)基合成培養(yǎng)基是根據(jù)細胞生存所需物質(zhì)的種類和數(shù)量，用人基本培養(yǎng)基的種類P252附表4MEMDMEMIMDMRPMI1640M199、M109HamF12McCoy5A細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101137基本培養(yǎng)基的種類P252附表4MEM細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101138細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101138細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101139細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011394.

18、2.2 培養(yǎng)基的配制（1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制 仔細閱讀說明書 配制要保證充分溶解 配制所用水應(yīng)為超純水細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011404.2.2 培養(yǎng)基的配制（1）基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制細胞工程第四章 合成培養(yǎng)基（粉） 1袋 碳酸氫鈉 2.0 g 青、鏈霉素 各100單位毫升 加三蒸水 至1000ml 過濾除菌，調(diào)節(jié)pH值至7.2 基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101141基礎(chǔ)培養(yǎng)基的配制細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101141基礎(chǔ)培養(yǎng)基 80一95血清 5一20（2）完全培養(yǎng)基有血清培養(yǎng)基的配制細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101142基礎(chǔ)培養(yǎng)基 80一95（2）完全培養(yǎng)人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，

19、要想使細胞生長和繁殖，還需補充一定量的天然培養(yǎng)基（如血清）。血清中含有： 多種蛋白質(zhì)（白蛋白、球蛋白、鐵蛋白等）； 多種金屬離子； 激素；各種生長因子； 促貼附物質(zhì)，如纖粘蛋白、冷析球蛋白、膠原等； 胰酶抑制因子； 轉(zhuǎn)移蛋白； 不明成分。 血 清細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101143人工合成培養(yǎng)基只能維持細胞生存，要想使細胞生長和繁殖，還需補一般說來，含5小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細胞可以維持細胞不死，但支持細胞生長一般需加10血清。對于血清支持細因生長的生物學(xué)效應(yīng)已得到證明，但對血清中的復(fù)雜成分至今尚未完全清楚。血清中不僅存在促細胞生長因子，同對也存在細胞生長抑制因子或毒性因子，因此在含血清培養(yǎng)基

20、中培養(yǎng)的細胞所反映的生物學(xué)特性是細胞和復(fù)雜血清因子的綜合反應(yīng)。在生長因子、蛋白質(zhì)工程、基因表達調(diào)控等研究領(lǐng)域，迫切需要用無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)細胞。血清的作用細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101144一般說來，含5小牛血清的培養(yǎng)基對大多數(shù)細胞可以維持細胞不死血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵。常用血清有胎牛血清、新生牛血清、小牛血清、兔血清、馬血清等，其中以胎牛血清質(zhì)量最好。優(yōu)質(zhì)血清的標(biāo)準(zhǔn)：透明，淡黃色，無沉淀物，無細菌、支原體、病毒污染。血清的滅活（消除補體活性）：56 ，30 分鐘。血清的消毒：過濾除菌。血清的使用細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101145血清質(zhì)量好壞是實驗成敗的關(guān)鍵。血清的使用細胞工程第四章細胞培2

21、.培養(yǎng)基的配制（3）無血清培養(yǎng)基基礎(chǔ)培養(yǎng)基添加成分細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011462.培養(yǎng)基的配制（3）無血清培養(yǎng)基細胞工程第四章細胞培養(yǎng)10無血清培養(yǎng)基的主要研制策略：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補充各種必需因子，如無血清細胞培養(yǎng)基的使用保證了實驗結(jié)果的準(zhǔn)確性、可重復(fù)性和穩(wěn)定性，減少了細胞污染，簡化了提純和鑒定各種細胞產(chǎn)物的程序。無血清培養(yǎng)基由基礎(chǔ)培養(yǎng)基和替代血清的補充成分組成。F12DMEM 添加成分（ECM、營養(yǎng)成分、生長因子、酶的抑制劑、結(jié)合蛋白、轉(zhuǎn)運蛋白）（3）無血清（無酚紅）培養(yǎng)基配制2.培養(yǎng)基的配制細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101147無血清培養(yǎng)基的主要研制策略：在基礎(chǔ)培養(yǎng)基中補充各種必需因子，

22、4.3 細胞的基本培養(yǎng)技術(shù)細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011484.3 細胞的基本培養(yǎng)技術(shù)細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101148 4.3.1. 原代細胞培養(yǎng) 是將機體內(nèi)的某組織取出，分散成單細胞，在人工條件下培養(yǎng)使其生存并不斷生長、繁殖的方法。借助這種方法可以觀察細胞的分裂繁殖、細胞的接觸抑制、以及細胞的衰老，死亡等生命現(xiàn)象。 最接近和反應(yīng)體內(nèi)生長特性細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101149 細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011491. 組織取材2. 組織細胞分離 機械法 消化法 3. 培養(yǎng)方法（1）組織塊（2）單層細胞培養(yǎng)（3）懸浮細胞培養(yǎng)細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011501. 組織取材細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1

23、01150組織塊培養(yǎng)法細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101151組織塊培養(yǎng)法細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101151Step 1 將小白鼠斷頸處死，然后用75%酒精或1 新潔爾滅浸泡消毒，迅速進入無菌室。 實驗1 成年小鼠腎臟細胞原代培養(yǎng)（組織塊培養(yǎng)法）細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101152Step 1 將小白鼠斷頸處死，然后用75%酒精或1 新潔Step 2 將小白鼠置超凈工作臺上，打開腹腔 細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101153Step 2 將小白鼠置超凈工作臺上，打開腹腔 細胞工程第四Step 3 用眼科剪和鑷，將腎外膜剪破，并將其剝向腎門，去腎外膜及脂肪，細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101154Step 3 用眼

24、科剪和鑷，將腎外膜剪破，并將其剝向腎門，去Step 4 剪碎組織細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101155Step 4 剪碎組織細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101155Step5 接種組織塊細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101156Step5 接種組織塊細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101156移入培養(yǎng)箱中（注意貼有組織塊的一面朝上），靜止23小時，然后將細胞培養(yǎng)瓶輕輕翻轉(zhuǎn)，繼續(xù)靜止培養(yǎng)。細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101157移入培養(yǎng)箱中（注意貼有組織塊的一面朝上），靜止23小時，然觀察2448小時后若培養(yǎng)液變成黃色且混濁，表示已被污染；若培養(yǎng)液變成紫色，一般細胞生長不好，則培養(yǎng)液pH過高；若培養(yǎng)液顯為橙黃、橘紅且清澈，一般顯

25、示細胞生長良好。在相差顯微鏡下觀察，若此時見細胞自組織邊緣長出。繼續(xù)培養(yǎng)35日，再換部分或全部培養(yǎng)液，待多數(shù)組織塊的生長暈相接，小心挑掉組織塊，繼續(xù)培養(yǎng)34天，細胞貼滿細胞培養(yǎng)瓶壁時便可進行傳代培養(yǎng)。 細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101158觀察2448小時后若培養(yǎng)液變成黃色且混濁，表示已被污染；細請觀看視頻教程！ 新生乳鼠心肌細胞原代培養(yǎng)細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101159請觀看視頻教程！細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011594.3.2 傳代培養(yǎng) 細胞由原培養(yǎng)瓶內(nèi)分離稀釋后傳到新的培養(yǎng)瓶的過程稱為傳代或者再培養(yǎng)。在體外傳代的細胞生長一代包括3個過程：潛伏期、生長對數(shù)期、平臺期。傳代培養(yǎng)分為：原代培養(yǎng)后第

26、一次傳代和常規(guī)傳代細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011604.3.2 傳代培養(yǎng) 細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011601. 第一次傳代培養(yǎng) 當(dāng)原代細胞生長到一定階段時，可以進行第一次傳代。從原代培養(yǎng)到第一次傳代的時間取決于原代培養(yǎng)的方法、培養(yǎng)細胞的活性、細胞類型和特點、接種的細胞密度、培養(yǎng)條件等。細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011611. 第一次傳代培養(yǎng)細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011612. 常規(guī)傳代培養(yǎng) （1）懸浮培養(yǎng)細胞傳代（2）貼壁細胞的消化法傳代細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011622. 常規(guī)傳代培養(yǎng)細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101162消化傳代的步驟消化法傳代培養(yǎng)步驟（2）貼壁細胞的消化法傳代細胞工程第四

27、章細胞培養(yǎng)101163消化傳代的步驟消化法傳代培養(yǎng)步驟（2）貼壁細胞的消化法傳代細用胰蛋白酶消化傳代abcdef細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101164用胰蛋白酶消化傳代abcdef細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011貼壁細胞的消化法傳代應(yīng)注意：1)適時傳代2)不同細胞的傳代要區(qū)別對待3)消化液濃度要適宜4）次傳代的細胞接種數(shù)量可適當(dāng)多一些細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101165細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011654.5 細胞的凍存、復(fù)蘇和運輸細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011664.5 細胞的凍存、復(fù)蘇和運輸細胞工程第四章細胞培養(yǎng)1011細胞凍存和復(fù)蘇細胞低溫冷凍貯存是細胞室的常規(guī)工作。細胞凍存與細胞傳代保存相比可

28、以減少入力、經(jīng)費，減少污染，減少細胞生物學(xué)特性變化。細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101167細胞凍存和復(fù)蘇細胞低溫冷凍貯存是細胞室的常規(guī)工作。細胞凍存與凍存當(dāng)細胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細胞器脫水，細胞中可溶性物質(zhì)濃度升高，并在細胞內(nèi)形成冰晶。應(yīng)用低溫保護劑和改進凍融方法細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101168凍存當(dāng)細胞冷到零度以下，可以產(chǎn)生以下變化：細胞器脫水，細胞低溫保護劑的應(yīng)用在細胞凍存時加入溫保護劑，能大大提高凍存效果。常用的低溫保護劑是DMSO，它是一種滲透性保護劑，可迅速透入細胞，提高胞膜對水的通透性，降低冰點，延緩凍結(jié)過程，能使細胞內(nèi)水分在凍結(jié)前透出細胞外，在胞外形成冰晶，減少胞內(nèi)冰

29、晶，從而減少冰晶對細胞的損傷。細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101169低溫保護劑的應(yīng)用在細胞凍存時加入溫保護劑，能大大提高凍存效果細胞凍存方法預(yù)先配制凍存液： 含20%血清培養(yǎng)基10% DMSO 取對數(shù)生長期細胞，經(jīng)胰酶消化后，加入適量凍存液, 用吸管吹打制成細胞懸液（1106 5 106細胞/ml)加入1ml細胞于凍存管中，密封后標(biāo)記冷凍細胞名稱和冷凍日期。1 年后，存活率可達80-90。DMSO液用培養(yǎng)液配好，避免因臨時配制產(chǎn)熱而傷害細胞。細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101170細胞凍存方法預(yù)先配制凍存液： 含20%血清培養(yǎng)基10% DM凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融 如果緩慢冷凍，可使細胞逐步脫水，細胞

30、內(nèi)不致產(chǎn)生大的冰晶；相反結(jié)晶就大，大結(jié)晶會造成細胞膜、細胞器的損傷和破裂。復(fù)蘇過程應(yīng)快融，目的是防止小冰晶形成大冰晶，即冰晶的重結(jié)晶。細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101171凍存和復(fù)蘇的原則：慢凍快融 細胞工程第四章細慢凍程序標(biāo)準(zhǔn)程序： 當(dāng)溫度在-25 以上時， 12 /min 當(dāng)溫度達-25 以下時， 510 /min 當(dāng)溫度達-100時，可迅速放入液氮中 細胞凍存器簡易程序 將冷凍管（管口要朝上）放入紗布袋內(nèi)，紗布袋系以線繩，通過線繩將紗布袋固定于液氮罐罐口，按每分鐘溫度下降12 的速度，在40分鐘內(nèi)降至液氮表面，停30分鐘后，直接投人液氮中。細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101172慢凍程序標(biāo)準(zhǔn)程序：

31、細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101172細胞復(fù)蘇方法（l）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37水浴中，使其融化（1分鐘左右）。（2）5分鐘內(nèi)用培養(yǎng)液稀釋至原體積的10倍以上。（3）低速離心10分鐘。（4）去上清，加新鮮培養(yǎng)液培養(yǎng)剛復(fù)蘇的細胞。細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101173細胞復(fù)蘇方法（l）從液氮中取出冷凍管，迅速投入37水浴中，請觀看視頻教程！ 細胞復(fù)蘇、傳代、凍存細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101174請觀看視頻教程！細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101174 4.3.3 常用培養(yǎng)技術(shù) 1. 懸滴培養(yǎng) 2. 培養(yǎng)瓶培養(yǎng) 3. 旋轉(zhuǎn)管培養(yǎng) 4. 克隆培養(yǎng)法 5. 細胞同步化培養(yǎng) 細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101175 細胞工程第四章細胞培養(yǎng)101175 4.3.3