超聲介導(dǎo)微泡造影劑對人HUVEC活性的影響

1、超聲介導(dǎo)微泡造影劑對人HUVEC活性的影響【摘要】目的討論超聲介導(dǎo)不同濃度微泡造影劑(SnVue)對人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞(HUVE)活性的影響。方法應(yīng)用TT比色法檢測不同濃度SnVue對HUVE活性的影響。結(jié)果超聲介導(dǎo)下，隨著SnVue濃度的增加，活細胞數(shù)呈減少趨勢。結(jié)論超聲介導(dǎo)下不同濃度SnVue對HUVE的活性有著不同的影響?！娟P(guān)鍵詞】超聲；微泡造影劑；人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞【Keyrds】Ultrasund；BA；HuanubilialvEInendthelialells(HUVEs)新近研究發(fā)現(xiàn)微泡造影劑BA可成為基因治療的一種平安、有效的載體。但是，假如超聲劑量過大，或BA濃度過高時，

2、利用超聲介導(dǎo)BA實現(xiàn)基因的定向轉(zhuǎn)移這一技術(shù)同樣也會對機體產(chǎn)生一定的有害的生物學(xué)效應(yīng)。影響B(tài)A介導(dǎo)基因治療效果的因素很多，除不同組織和基因種類的影響外，超聲能量、輻照時間、基因與微泡比例等諸多因素均可對基因治療產(chǎn)生影響。本研究通過觀察超聲介導(dǎo)BA對體外培養(yǎng)的人臍靜脈血管內(nèi)皮細胞HUVE的作用，討論應(yīng)用超聲介導(dǎo)BA對HUVE活性的影響。1材料與方法1.2實驗方法1.2.1細胞培養(yǎng)含10%FBS的1640細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)HUVE，每12d換液1次，每34d傳代1次。1.2.2SnVue的配制1.68l注射用生理鹽水0.9%Nal參加SnVue藥瓶中每瓶含SF659g，凍干粉25g，劇烈震蕩20s至瓶內(nèi)

3、藥物混合均勻后備用此時SnVue濃度為50g/l，以下稱初SnVue。1.2.3體外實驗TT比色法測定不同濃度SnVue對HUVE活性的影響1.2.3.1實驗分組按照添加SnVue濃度不同分為A組：每孔加初SnVue濃度為50g/l50l。B組：將初SnVue稀釋2倍后濃度為25g/l，每孔加50l。組：將初SnVue稀釋3倍后濃度約17g/l，每孔加50l。D組：將初SnVue稀釋4倍后濃度為12.5g/l，每孔加50l。E組：對照組，每孔加生理鹽水50l。F組：空白對照組，不加細胞和SnVue，每孔加200l培養(yǎng)液。以上6組每組8孔。1.2.3.2實驗步驟1培養(yǎng)細胞參加條件：用0.25%胰

4、酶消化單層培養(yǎng)細胞，用含10%FBS的1640培養(yǎng)液配成細胞懸液，以每孔含104個細胞接種于96孔培養(yǎng)板中，每孔體積150l。如上所述，每組參加不同濃度的SnVue，然后超聲輻照，培養(yǎng)皿固定于37水浴箱水面，探頭距培養(yǎng)皿底部約30。輻照條件：超聲機械指數(shù)1.4，輻照時間為60s。2培養(yǎng)細胞：經(jīng)上述處理后將細胞培養(yǎng)板放入2孵箱，在37、5%2及飽和濕度條件下，培養(yǎng)20h。3呈色：培養(yǎng)20h后，每孔參加TT溶液10l，37，繼續(xù)孵育4h，終止培養(yǎng)，仔細吸棄孔內(nèi)培養(yǎng)上清液。然后每空參加DS150l，振蕩10in。4比色：在酶聯(lián)免疫檢測儀上選定490n波長，測各孔光吸收值，記錄結(jié)果。整個實驗重復(fù)3次。

5、TT測細胞活性，E組細胞的存活率為100，AD組細胞的存活率=每組細胞的吸光值/E組的吸光值100%。1.3統(tǒng)計學(xué)處理計量資料采用xs表示。使用SPSS12.0軟件作方差分析。2結(jié)果2.1IS觀察正常生長的HUVE大部分貼壁。早期細胞呈多角、球形，少數(shù)細胞伸展，2448h生長最快，逐漸生長成梭形，有些細胞排列呈魚貫狀相連，間有旋渦狀排列。核明晰，呈圓形或橢圓形，核分裂相多見，12核仁，胞漿豐富，內(nèi)含小顆粒。于23d后交融，57d胞體呈多角形，互相嵌合，為單層呈鋪路石狀排列。見圖1。圖中箭頭所示皺縮、致密度高的細胞為凋亡細胞圖1傳代后第5天HUVE1002.2TT比色法測定不同濃度SnVue對H

6、UVE活性的影響不同濃度SnVue對HUVE活性的影響不同。超聲介導(dǎo)初SnVue及其稀釋2倍時細胞存活率較低，分別為639%及659%；初SnVue稀釋3倍時細胞存活率增高8811%，且與前兩者比擬有顯著差異P0.01，初SnVue稀釋4倍905%與稀釋3倍時比擬，對細胞存活率無顯著影響P0.05。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3討論本研究說明，在超聲介導(dǎo)下不同濃度SnVue對HUVE活性的影響不同。隨著SnVue濃度的增加，存活細胞百分比呈減少趨勢。這說明，超聲介導(dǎo)下不同濃度SnVue對HUVE的活性有著不同的影響。超聲介導(dǎo)BA這一技術(shù)應(yīng)用于基因治療是因為它的理化性質(zhì)可以產(chǎn)生特有的生物學(xué)效應(yīng)，主要是

7、聲空化效應(yīng)?？栈?yīng)是指液體中的微小氣泡核在超聲波作用下被激化，表現(xiàn)為泡核的振蕩、生長、收縮及崩潰等一系列動力學(xué)過程，這一過程可以把聲場能量高度集中于極小的空化泡內(nèi)，并在空化泡快速閉合的瞬間產(chǎn)生放電、發(fā)光、高溫、高壓、高能量、沖擊波、微射流及微聚變等物理和化學(xué)效應(yīng)。在該過程中，周圍組織的細胞壁和質(zhì)膜被擊穿產(chǎn)生可逆或不可逆的小孔。本研究采用的SnVue為內(nèi)含不同氣體的微氣泡，能降低超聲波的空化閾值，增強空化效應(yīng)。超聲介導(dǎo)SnVue可對靶細胞產(chǎn)生一系列生物學(xué)效應(yīng)，其中的空化效應(yīng)可使細胞膜通透性增加1，2。SnVue內(nèi)含的微氣泡能增強空化效應(yīng)并降低空化效應(yīng)的閾值3，4?？栈?yīng)一方面使細胞膜外表出現(xiàn)可逆性小孔，細胞膜的通透性增高，外源基因較容易地經(jīng)細胞膜上的小孔進入細胞內(nèi)；同時又使SnVue破壞后在部分高濃度地釋放出所攜帶的基因，從而增強外源性基因的攝娶轉(zhuǎn)染和表達；另一方面又能損傷組織和細胞。Skyba等5用活體顯微鏡觀察大鼠斜方肌血管，在輸入SnVue之前，超聲輻照沒有引起微血管的破壞，僅輸入SnVue不進展超聲輻照，也未引起微血管的破壞，只有輸入SnVue同時進展超聲輻照，才發(fā)現(xiàn)直徑7微血管的破裂，血細胞外滲到組織間隙，這種效應(yīng)與使用超聲輻照的機械指數(shù)呈正相關(guān)。iller等6研究了超聲波對人體表皮癌細胞的損害，發(fā)現(xiàn)癌細胞的破壞與是否使用微泡關(guān)