熒光原位雜交(課件)

1、熒光原位雜交熒光原位雜交(fluorescence in situ hybridization, FISH)熒光原位雜交是在20世紀(jì)80年代末在放射性原位雜交技術(shù)的基礎(chǔ)上發(fā)展起來的一種非放射性分子細(xì)胞遺傳技術(shù),以熒光標(biāo)記取代同位素標(biāo)記而形成的一種新的原位雜交方法,探針首先與某種介導(dǎo)分子(reporter molecule)結(jié)合,雜交后再通過免疫細(xì)胞化學(xué)過程連接上熒光染料.熒光原位雜交FISH的原理FISH的操作及應(yīng)用FISH的展望FISH的原理FISH的基本原理是用已知的標(biāo)記單鏈核酸為探針，按照堿基互補(bǔ)的原則，與待檢材料中未知的單鏈核酸進(jìn)行特異性結(jié)合，形成可被檢測(cè)的雜交雙鏈核酸。由于DNA分子

2、在染色體上是沿著染色體縱軸呈線性排列，因而可以將探針直接與染色體進(jìn)行雜交從而將特定的基因在染色體上定位。目前這項(xiàng)技術(shù)已經(jīng)廣泛應(yīng)用于動(dòng)植物基因組結(jié)構(gòu)研究、染色體精細(xì)結(jié)構(gòu)變異分析、病毒感染分析、人類產(chǎn)前診斷、腫瘤遺傳學(xué)和基因組進(jìn)化研究等許多領(lǐng)域。熒光原位雜交原有的放射性同位素原位雜交技術(shù)存在著較多缺點(diǎn)，諸如每次檢驗(yàn)均 需重新標(biāo)記探針，已標(biāo)記的探針表現(xiàn)出明顯的不穩(wěn)定性，需要較和時(shí)間的曝光時(shí)間和對(duì)環(huán)境的污染等。在觀察結(jié)果時(shí)，需要較多的分裂進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。此外，由于放射性銀粒和染色體聚集的不同平面，可能引起計(jì)數(shù)上的誤 差等。與之比FISH的優(yōu)點(diǎn)操作操作簡便,探針標(biāo)記后穩(wěn)定,一次標(biāo)記后可使用二年方法敏感,

3、能迅速得到結(jié)果在同一標(biāo)本上,可同時(shí)檢測(cè)幾種不同探針.不僅可用于分裂期細(xì)胞染色體數(shù)量或結(jié)構(gòu)變化的研究,而且還可用于間期細(xì)胞的染色體數(shù)量及基因改變的研究. 缺點(diǎn)：不能達(dá)到100%雜交，特別是在應(yīng)用較短的cDNA探針時(shí)效率明顯下降。熒光原位雜交FISH技術(shù)包括下列幾個(gè)步驟：1）探針的制備和標(biāo)記 2）探針及標(biāo)本變性3）雜交4）洗脫5）雜交信號(hào)的放大（適用于使用生物素標(biāo)記的探針）6）封片7）熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果熒光原位雜交探針的制備和標(biāo)記 探針是一段帶有熒光色素或（半）抗原的核苷酸序列。其長度介于15至數(shù)千個(gè)核苷酸之間，但以250650個(gè)核苷酸雜交效果最好探針的熒光素標(biāo)記可以采用直接和間接標(biāo)記的方

4、法。間接標(biāo)記是采用生物素標(biāo)記DNA探針，雜交之后用藕聯(lián)有熒光素親和素或者鏈霉親和素進(jìn)行檢測(cè)，同時(shí)還可以利用親和素-生物素-熒光素復(fù)合物，將熒光信號(hào)進(jìn)行放大，從而可以檢測(cè)500bp的片段。直接標(biāo)記是將熒光素直接與探針核苷酸或磷酸戊糖骨架共價(jià)結(jié)合，或在缺口平移法標(biāo)記探針時(shí)將熒光素核苷三磷酸摻入。直接標(biāo)記法在檢測(cè)時(shí)步驟簡單，但由于不能進(jìn)行信號(hào)放大，因此靈敏度不如間接標(biāo)記的方法。熒光原位雜交單拷貝探針：（1）種類：YAC， BAC， Cosmid，Plasmid， cDNA片段 （2）應(yīng)用 （a）定位DNA片段及嵌合體克隆驗(yàn)證； （b）確定染色體微小缺失與重復(fù)； （c）染色體斷裂點(diǎn)分析。 （d）間期細(xì)

5、胞染色體數(shù)目異常診斷。熒光原位雜交單拷貝探針DNA片段的染色體定位熒光原位雜交單拷貝探針FISH檢測(cè)微小缺失熒光原位雜交單拷貝探針FISH檢測(cè)微小缺失熒光原位雜交染色體片段重復(fù) Dup 19(p13.2-13.1)熒光原位雜交簡單重復(fù)序列探針簡單重復(fù)序列探針(simple repetitive probes)異染色質(zhì)著絲粒探針(heterochromatic centromer probes)其靶序列為衛(wèi)星DNA或衛(wèi)星III DNA(alpha satellite/satellite III DNA)多位于染色體的著絲粒和異染色質(zhì)區(qū)域，重復(fù)數(shù)百次至數(shù)千次。特點(diǎn)：信號(hào)強(qiáng)應(yīng)用：(a)標(biāo)記染色體識(shí)別

6、 (b)染色體數(shù)目異常檢測(cè) (c)間期細(xì)胞遺傳學(xué)研究和臨床診斷熒光原位雜交簡單重復(fù)序列探針熒光原位雜交染色體的著絲粒異染色質(zhì)區(qū)域簡單重復(fù)序列探針間期細(xì)胞遺傳學(xué)的意義：細(xì)胞分裂期僅占整個(gè)細(xì)胞周期的幾分之一至幾十分之一，經(jīng)細(xì)胞培養(yǎng)和相應(yīng)處理才能獲得染色體。人體的大部分細(xì)胞并不進(jìn)行分裂，很難通過培養(yǎng)獲得中期染色體分裂相，間期FISH為這一時(shí)期遺期傳物質(zhì)的研究提供了可能，而且快速。熒光原位雜交染色體涂染探針染色體涂染探針(chromosome painting probes) 整條染色體探針或染色體區(qū)帶特異性探針探針來源：（1）含有人單條染色體的人-嚙齒類(human-rodent)體細(xì)胞雜種組織融合

7、的產(chǎn)物；（2）熒光激活的流式細(xì)胞儀(fluorescence-activated cell sorter,FACS)分離整條染色體DNA，并以載體克隆/PCR擴(kuò)增；（3）顯微切割得到染色體或染色體片段，PCR擴(kuò)增；應(yīng)用（1）染色體數(shù)目和結(jié)構(gòu)異常分析； （2）不同物種間的同源性比較； （3）白血病及其它腫瘤的染色體診斷和研究。熒光原位雜交染色體涂染探針人類染色體結(jié)構(gòu)分析熒光原位雜交染色體涂染探針：染色體結(jié)構(gòu)異常分析熒光原位雜交多色復(fù)合染色體FISH探針多色FISH（muti-color FISH) 多色復(fù)合染色體FISH探針(multiplex FISH, M-FISH probes) 兩種以上

8、不同的非同位素標(biāo)記，不同的熒光檢測(cè)系統(tǒng)，通過不同的濾光片組合或極少數(shù)幾種非同位素標(biāo)記探針后，按照不同的比例混合，可以顯示多種顏色。熒光原位雜交多色復(fù)合染色體FISH探針熒光原位雜交探針及標(biāo)本的變性1）探針變性將探針在75oC恒溫水浴中溫育5min，立即置0oC，510min，使雙鏈DNA探針變性。2）標(biāo)本變性將制備好的染色體玻片標(biāo)本于50oC培養(yǎng)箱中烤片23h。（經(jīng)Giemsa染色的標(biāo)本需預(yù)先在固定液中退色后再烤片）。取出玻片標(biāo)本，將其浸在7075oC的體積分?jǐn)?shù)70甲酰胺/2SSC的變性液中變性23min。立即按順序?qū)?biāo)本經(jīng)體積分?jǐn)?shù)70、體積分?jǐn)?shù)90和體積分?jǐn)?shù)100冰乙醇系列脫水，每次5min

9、，然后空氣干燥。熒光原位雜交雜交 將已變性或預(yù)退火的DNA探針10L 滴于已變性并脫水的玻片標(biāo)本上，蓋上1818蓋玻片，用Parafilm封片，置于潮濕暗盒中37oC雜交過夜（約1517h）。由于雜交液較少，而且雜交溫度較高，持續(xù)時(shí)間又長，因此為了保持標(biāo)本的濕潤狀態(tài)，此過程在濕盒中進(jìn)行。熒光原位雜交洗脫此步驟有助于除去非特異性結(jié)合的探針，從而降低本底。（1） 雜交次日，將標(biāo)本從37oC溫箱中取出，用刀片輕輕將蓋玻片揭掉。（2） 將已雜交的玻片標(biāo)本放置于已預(yù)熱4250oC的體積分?jǐn)?shù)50甲酰胺/2SSC中洗滌3次，每次5min。（3） 在已預(yù)熱4250oC的1SSC中洗滌3次，每次5min。（4）

10、 在室溫下，將玻片標(biāo)本于2SSC中輕洗一下。（5） 取出玻片，自然干燥。（6） 取200L復(fù)染溶液（PI/antifade或DAPI/antifade染液）滴加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片。熒光原位雜交（1） 在玻片的雜交部位加150L封閉液I，用保鮮膜覆蓋，37oC溫育20min。（2） 去掉保鮮膜，再加150L avidin-FITC于標(biāo)本上，用保鮮膜覆蓋， 37oC繼續(xù)溫育40min。（3） 取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱4250oC的洗脫液中洗滌3次，每次5min。（4） 在玻片標(biāo)本的雜交部位加150L封閉液II，覆蓋保鮮膜，37oC溫育20min。（5） 去掉保鮮膜，加150L antiavi

11、din于標(biāo)本上，覆蓋新的保鮮膜，37oC溫育40min。（6） 取出標(biāo)本，將其放入已預(yù)熱4250oC的新洗脫液中，洗滌3次，每次5min。（7） 重復(fù)步驟(1)、（2）、（3），再于2SSC中室溫清洗一下。（8） 取出玻片，自然干燥。（9） 取200L PI/antifade染液滴加在玻片標(biāo)本上，蓋上蓋玻片。雜交信號(hào)的放大（適用于使用生物素標(biāo)記的探針）熒光原位雜交可采用不同類型的封片液。如果封片液中不含有Mowiol（可使封片液產(chǎn)生自封閉作用），為防止蓋片與載片之間的溶液揮發(fā)，可使用指甲油將蓋片周圍封閉。封好的玻片標(biāo)本可以在-20-70oC的冰箱中的暗盒中保持?jǐn)?shù)月之久。 封片熒光原位雜交先在可

12、見光源下找到具有細(xì)胞分裂相的視野，然后打開熒光激發(fā)光源。FITC的激發(fā)波長為490nm。細(xì)胞被PI染成紅色，經(jīng)FITC標(biāo)記的探針?biāo)诘奈恢冒l(fā)出綠色熒光。熒光顯微鏡觀察FISH結(jié)果熒光原位雜交所用不同熒光材料的激發(fā)光和發(fā)射光波長及濾光鏡選擇熒光原位雜交FISH技術(shù)的應(yīng)用FISH技術(shù)的應(yīng)用1）基因（或DNA片段）的染色體定位；2）染色體數(shù)目與結(jié)構(gòu)異常的檢測(cè)；3）間期細(xì)胞遺傳學(xué)（絨毛/羊水/精子/卵裂球/其它間期細(xì)胞研究與診斷）；4）腫瘤遺傳學(xué)研究熒光原位雜交FISH的展望 熒光原位雜交技術(shù)已越來越廣泛的應(yīng)用在細(xì)胞遺傳學(xué)、 育種學(xué)、醫(yī)學(xué)等多個(gè)領(lǐng)域,尤其在檢測(cè)遺傳物質(zhì)的突變和染色 體上基因定位等方面顯示了極大的優(yōu)勢(shì)。隨著分子生物學(xué)的發(fā)展, 新探針的不斷出現(xiàn)特別是全探針及染色體原位抑制雜交技術(shù)的出現(xiàn),計(jì) 算機(jī)輔助的共焦顯微系統(tǒng)和數(shù)字成像系統(tǒng)的發(fā)展,FISH技術(shù)的應(yīng)用會(huì)加深加 快人類在腫瘤學(xué)、產(chǎn)前診斷、哺乳動(dòng)物的染色體進(jìn)化研究及親緣關(guān)系等領(lǐng)域的認(rèn)識(shí)。FISH的展望 FISH技術(shù)和RFLP（Restrict Fragment Lenth Polymorphysim）結(jié)合，可以更精確地描