黃酒糟蛋白提取工藝研究畢業(yè)論文

1、米酒粒中蛋白質(zhì)的提取工藝 HYPERLINK %20%20%20%20:/biological%20engineering 生物工程專業(yè)摘要：黃酒起源于中國(guó)。黃酒釀造業(yè)的主要副產(chǎn)品黃酒谷也是豐富的蛋白質(zhì)資源。但其能量較低，不溶性物質(zhì)較多，不能直接使用，造成蛋白質(zhì)資源的極大浪費(fèi)。通過單因素和正交實(shí)驗(yàn)，確定了酶法提取蛋白質(zhì)的最佳條件，并得到了應(yīng)用。 ：酶用量2 000u/g ， pH 10，溫度50，反應(yīng)時(shí)間2h，料水比1:8。在此條件下，蛋白提取率為47.40%。關(guān)鍵詞：黃酒糧蛋白質(zhì)；堿性磷酸酶；蛋白質(zhì)的提取率；萃取技術(shù)目錄 TOC o 1-3 u 1 簡(jiǎn)介 PAGEREF _Toc358492

2、098 h 11.1 米酒糟介紹 PAGEREF _Toc358492099 h 11.1.1 酒糟的來源 PAGEREF _Toc358492100 h 11.1.2 酒糟的主要成分 PAGEREF _Toc358492101 h 11.1.3 酒糟研究現(xiàn)狀 PAGEREF _Toc358492101 h 11.2 酒糟蛋白 PAGEREF _Toc358492104 h 2的開發(fā)價(jià)值1.3 酒糟蛋白提取工藝可行性分析 PAGEREF _Toc358492107 h 31.4 本課題研究?jī)?nèi)容 32 測(cè)試材料和方法42.1 測(cè)試材料42.1.1 測(cè)試材料 42.1.2 檢測(cè)試劑 42.1.3

3、試驗(yàn)裝置 52.2 測(cè)試方法52.2.1 原料預(yù)處理及工藝流程 52.2.2 蛋白質(zhì)6的標(biāo)準(zhǔn)曲線制備2.2.3 單因素測(cè)試 62.2.4原料中總蛋白含量和蛋白提取率的計(jì)算72.2.5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)83 結(jié)果與分析9蛋白質(zhì)的標(biāo)準(zhǔn)曲線93.2 原料中總蛋白質(zhì)含量93.3 測(cè)試結(jié)果分析93.3.1 酶添加量對(duì)蛋白提取率的影響93.3.2 pH對(duì)蛋白提取率的影響103.3.3 反應(yīng)溫度對(duì)蛋白提取率的影響103.3.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響1 13.3.5 固液比對(duì)蛋白提取率的影響1 13.3.6 正交試驗(yàn)1 14 結(jié)論 1 5參考文獻(xiàn)1 6至1 71簡(jiǎn)介1.1 米酒糟介紹1.1.1 酒糟的來源黃

4、酒，又稱黃酒，是我國(guó)的國(guó)家特產(chǎn)；它是世界上最古老的葡萄酒之一；它是中國(guó)獨(dú)有的，是酒之祖，酒中之王。其釀造技術(shù)獨(dú)樹一幟，堪稱“天下第一” 。其中，以米酒為代表的麥曲米酒是米酒歷史上歷史最悠久、最具代表性的產(chǎn)品。米酒是以大米和小米為原料，以小麥曲或酒曲為糖化發(fā)酵劑制成。經(jīng)蒸煮，與小麥曲、米曲或酒藥混合，糖化發(fā)酵釀制而成的酒，享有“國(guó)酒”的美譽(yù)。其酒溫和淡雅，風(fēng)味醇厚，香氣濃郁，營(yíng)養(yǎng)豐富，已成為我國(guó)廣泛消費(fèi)的第一款酒精飲料。酒糟是黃酒釀造行業(yè)的主要副產(chǎn)品，數(shù)量巨大，來源集中。中國(guó)有500多家黃酒生產(chǎn)企業(yè)，黃酒酒糟的數(shù)量相當(dāng)可觀。酒糟的各種成分主要來自釀造原料。同時(shí)，糖化發(fā)酵過程中發(fā)生了一系列復(fù)雜的生

5、化變化，從而增加了一些新一代產(chǎn)品。此外，發(fā)酵后沉淀出大量酵母細(xì)胞，壓榨后殘留在酒糟中，大部分營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)也得以保存，因此黃酒糟的研究和利用將具有非常廣闊的應(yīng)用前景。1.1.2 酒糟的主要成分酒糟的成分和成分大體相似，但百分比略有不同。由于從原料到酒精的糖化、發(fā)酵等一系列復(fù)雜的生化變化，產(chǎn)生了一些新的物質(zhì)。一般來說，酒糟的主要成分是乙醇、淀粉、糖、纖維素、糊精、灰分、豐富的蛋白質(zhì)和一些風(fēng)味物質(zhì)（揮發(fā)性酸和非揮發(fā)性酸等） 。含蛋白質(zhì)30%40%左右，是一種具有開發(fā)潛力的蛋白質(zhì)飼料資源，但含水量高，不易長(zhǎng)期保存，易造成環(huán)境污染。其中氨基酸種類齊全，谷氨酸含量最高，其次是亮氨酸和天冬氨酸。釀造黃酒選用的原

6、料為大米時(shí)，其蛋白質(zhì)含量約為8% ；如果以小麥為原料，蛋白質(zhì)含量高達(dá)12%。在釀造米酒的過程中，只用到了原料中的糖分，大部分蛋白質(zhì)沒有得到充分利用，最后留在了米酒糟中，可以說米酒糟是一種豐富的蛋白質(zhì)資源。采用分級(jí)沉降法對(duì)酒糟蛋白的組成進(jìn)行分析，可知面筋和球蛋白是主要成分。1.1.3 酒糟研究現(xiàn)狀黃酒，世界上最古老的葡萄酒之一。雖然米酒的生產(chǎn)已有數(shù)千年的歷史，但對(duì)米酒酒糟的研究始于1980年代后期。由于酒糟中含有大量不溶性物質(zhì)，難以直接使用。它對(duì)酒廠來說是一種浪費(fèi)，僅作為 HYPERLINK %20%20%20%20:/%20%20%20%20askci%20%20%20%20/reports/

7、index1107.html t :/ askci /news/201404/16/_blank 飼料處理甚至腐爛，導(dǎo)致酒糟中的蛋白質(zhì)、有機(jī)酸、還原糖和脂肪等資源的可用性。坐等大浪費(fèi)也會(huì)污染環(huán)境。部分酒糟還可以作為繼續(xù)生產(chǎn)白酒或醋的原料，但同時(shí)很多關(guān)于酒糟的研究還沒有應(yīng)用到實(shí)際生產(chǎn)中。目前，酒糟的研究方向主要集中在酒糟液的分析、測(cè)定和性能比較、酒糟液的分離處理、酒糟分離液和酒糟的綜合開發(fā)利用等方面。而在這么多酒糟研究中，啤酒酒糟研究占了絕大多數(shù)。在為數(shù)不多的酒糟研究中，關(guān)于酒糟蛋白質(zhì)的研究較少。下面就國(guó)外學(xué)者對(duì)酒糟的研究與開發(fā)進(jìn)行簡(jiǎn)要的探討。陶使用米酒糟通過連續(xù)和深層發(fā)酵生產(chǎn)醋。顧海先等。在研

8、究生產(chǎn)特制鮮醬油的技術(shù)時(shí)，使用復(fù)合風(fēng)味蛋白酶、面筋酸蛋白酶和面筋糖化酶水解米酒糟。國(guó)軍在生產(chǎn)“香糯米糠”時(shí)，在米酒糟中加入了天然植物混合香料等調(diào)味料。王素平利用固態(tài)發(fā)酵酒糟開發(fā)酵母蛋白飼料。王建國(guó)等。酒糟酸水解產(chǎn)生復(fù)合氨基酸。國(guó)外也有學(xué)者用酒糟生產(chǎn)甘油，或生產(chǎn)淀粉酶和纖維素酶，生產(chǎn)制糖活性炭，外用治療關(guān)節(jié)炎等疾病。目前，酒糟以其年產(chǎn)量大、工業(yè)副產(chǎn)品多、營(yíng)養(yǎng)豐富等特點(diǎn)，引起了國(guó)外研究人員的關(guān)注。在各項(xiàng)研究中，利用酒糟生產(chǎn)飼料、培育食用菌、進(jìn)行厭氧發(fā)酵生產(chǎn)沼氣等方面的研究比較深入和廣泛，既節(jié)約了資源，又保護(hù)了生態(tài)環(huán)境。1.2 酒糟蛋白的開發(fā)價(jià)值近年來，隨著世界人口的快速增長(zhǎng)和環(huán)境的迅速惡化，蛋白質(zhì)

9、資源的匱乏已成為全人類需要共同面對(duì)的嚴(yán)重問題。開辟新的蛋白質(zhì)資源和提高飼料蛋白質(zhì)產(chǎn)量的問題迫在眉睫。此外，酒糟的BOD值（生化需氧量或生化耗氧量，是衡量水中有機(jī)物等需氧污染物含量的綜合指標(biāo)）極高。如果未經(jīng)處理直接排入河流，將造成嚴(yán)重的環(huán)境污染。對(duì)于當(dāng)前的蛋白質(zhì)資源，特別是我國(guó)大量低值蛋白質(zhì)資源的精深加工，是解決長(zhǎng)期以來嚴(yán)重制約我國(guó)食品工業(yè)發(fā)展的必然途徑。植物蛋白具有很高的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值，是人們賴以生存的大量蛋白質(zhì)資源。酒糟蛋白質(zhì)含量豐富，品質(zhì)優(yōu)良，其中水不溶性面筋含量最多；與大米蛋白質(zhì)相比，大米酒糟中的蛋白質(zhì)具有堿溶解度較低的優(yōu)點(diǎn)。被蛋白酶水解后成為水解蛋白。水解蛋白具有人體生成和生理調(diào)節(jié)功能，易于

10、消化吸收，食用安全性高，可作為保健食品的原料。此外，它可以改善口感，增加風(fēng)味，因此被廣泛用于飲料和其他相關(guān)食品行業(yè)，作為一種理想的風(fēng)味物質(zhì)和營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑。但是，目前的技術(shù)還不成熟，還沒有完全轉(zhuǎn)化為更合理、更有價(jià)值的資源。大量的酒糟僅作為廉價(jià)飼料，甚至可能發(fā)霉，污染環(huán)境。酒糟營(yíng)養(yǎng)豐富。研究其蛋白質(zhì)提取工藝，不僅可以降低黃酒企業(yè)的生產(chǎn)成本，還可以有效減少環(huán)境污染。因此，研究酒糟蛋白的最佳提取工藝對(duì)其綜合利用具有重要意義。在酒糟的研究、開發(fā)和利用過程中，從變廢為寶的角度出發(fā)，需要開創(chuàng)既能減少環(huán)境污染，又能節(jié)約資源、降低生產(chǎn)成本的新思路。同時(shí)，由于黃酒糟、白酒糟和酒糟的成分含量比較相似，因此對(duì)黃酒糟蛋白

11、的深入研究開發(fā)也為其他酒糟的開發(fā)利用提供了重要參考。 .1.3 酒糟蛋白提取工藝可行性分析酒糟蛋白屬于植物蛋白的一種。植物蛋白的提取方法很多，最常用的有酸法、堿溶酸沉法和酶法。傳統(tǒng)方法主要以酸提為主，但由于酸解溫度較高，一般在100以上。原料中的碳水化合物易脫水，含硫氨基酸分解生成含硫化合物，使產(chǎn)品有異味。而且水解程度難以控制，活性肽含量低，水解液中鹽含量高。堿溶性酸沉法是一種簡(jiǎn)單易行的提取方法，例如在大豆蛋白的分離提取中有著非常廣泛的應(yīng)用。但在高堿性條件下，堿水解會(huì)引起蛋白質(zhì)變性水解，氨基酸結(jié)構(gòu)會(huì)被破壞，蛋白質(zhì)的營(yíng)養(yǎng)價(jià)值也會(huì)降低，非蛋白質(zhì)成分也會(huì)增加，難以提取。蛋白質(zhì)。酶法是通過植物蛋白的酶

12、解提取，將蛋白質(zhì)分解成分子量較小的氨基酸和多肽。酶解反應(yīng)條件溫和，副反應(yīng)少，有害物質(zhì)少，水解程度易于控制，特別是在營(yíng)養(yǎng)成分的保留方面具有無可比擬的優(yōu)勢(shì)。因此，酶法提取蛋白質(zhì)是植物蛋白質(zhì)提取的一個(gè)指標(biāo)，甚至是未來食品和生化工藝的發(fā)展方向。堿切蛋白酶是通過地衣芽孢桿菌發(fā)酵獲得的。主要成分是枯草桿菌蛋白酶，它是一種肽酶。催化位點(diǎn)為絲氨酸，分子量約27300，能水解蛋白質(zhì)分子的肽鏈生成多肽或氨基酸，具有很強(qiáng)的分解蛋白質(zhì)的能力。在堿性環(huán)境（pH為912）中，蛋白質(zhì)被催化，產(chǎn)生的主要物質(zhì)是肽和氨基酸。最適溫度范圍為4055，用量一般為5002500u/g。堿性裂解蛋白酶水解酒糟，因?yàn)槠溥m宜的作用條件是在堿

13、性環(huán)境中，更有利于面筋等堿溶性蛋白質(zhì)的溶解。因?yàn)榫圃愕鞍卓梢酝ㄟ^堿提來制備，所以堿酶的高提取率部分歸功于堿提的作用。堿性裂解蛋白酶對(duì)天然底物具有很強(qiáng)的特異性，并具有末端疏水氨基酸的特異性。主要裂解疏水性氨基酸的末端，如：亮氨酸、異亮氨酸、纈氨酸等，而疏水性氨基酸末端的苦度低于肽鏈之間的苦味。另外，由于堿性裂解蛋白酶為微生物酶，來源廣泛，成本低廉，適合工業(yè)化生產(chǎn)。是一種理想的工業(yè)酶。因此，考慮到蛋白質(zhì)的提取效率和避免蛋白質(zhì)水解物的苦味，本課題決定使用堿性蛋白酶來研究酒糟蛋白質(zhì)的酶法提取工藝。1.4 本課題研究?jī)?nèi)容本課題以大米酒糟為原料，研究黃酒糟蛋白質(zhì)的酶法提取工藝，旨在充分開發(fā)利用含量最大的非

14、水溶性麥谷蛋白，提高蛋白質(zhì)的提取效率。這樣可以大大緩解我國(guó)蛋白質(zhì)資源匱乏的嚴(yán)峻形勢(shì)，有效發(fā)展經(jīng)濟(jì)，實(shí)現(xiàn)食品工業(yè)、化工、農(nóng)業(yè)、環(huán)保等方面的可持續(xù)發(fā)展。2 試驗(yàn)材料和方法2.1 測(cè)試材料2.1.1 測(cè)試材料表1 試驗(yàn)原料原料名稱購(gòu)物時(shí)間起源米酒糟2015 年 4 月省市2.1.2 檢測(cè)試劑表2 試驗(yàn)所用主要試劑試劑制造商（原產(chǎn)地）纖維素酶 15000u/g堿性裂解蛋白酶 200000u/g混合指標(biāo)濃硫酸復(fù)盛實(shí)業(yè)金源生物科技City Comeo 化學(xué)試劑致遠(yuǎn)化學(xué)試劑過氧化氫致遠(yuǎn)化學(xué)試劑氫氧化鈉硫酸鉀城市迪恩化學(xué)試劑國(guó)藥化學(xué)試劑硼酸化學(xué)試劑公司鹽酸中平能源化工集團(tuán)東大化工CuSO 4 5H 2 O化學(xué)

15、試劑公司牛血清白蛋白化學(xué)試劑公司2.1.3 測(cè)試設(shè)備姓名模型制造商電子天平BS-210S賽多利斯天平高速萬能粉碎機(jī)FW-100中興偉業(yè)儀器電熱恒溫振蕩水箱SHC-28杜甫儀表廠電加熱恒溫干燥箱CS101-A市永光醫(yī)療器械廠電動(dòng)恒溫水浴HH-S鞏義裝備721分光光度計(jì)721精密儀器廠低溫高速離心機(jī)TDL-40B中興偉業(yè)儀器全自動(dòng)純水蒸餾器SZ-96亞榮生化儀器廠空氣干燥器KQ-B長(zhǎng)城科技工貿(mào)精密pH計(jì)酸堿度 S-25精科雷磁表 3 測(cè)試使用的主要儀器刻度試管、燒杯、容量瓶、三角瓶、移液管和天平是實(shí)驗(yàn)室常用的玻璃儀器。2.2 測(cè)試方法2.2.1 原料預(yù)處理及工藝流程(1) 原料預(yù)處理 酒糟粉的制備

16、干燥后的酒糟用高速粉碎機(jī)粉碎，然后過60目篩。 清洗并去除雜質(zhì)準(zhǔn)確稱取酒糟粉3.00g，按1:6的比例加水，攪拌使酒糟粉均勻分散在水中，在60水浴中搖晃30分鐘，然后以 4000 r/min 的速度離心 5 分鐘，棄去上清液。 纖維素酶水解水洗后，酒糟中仍有一些不溶性物質(zhì)如粗纖維不能有效去除，只能用酸法或酶法降解。因此，還需要用纖維素酶降解纖維素，從而釋放蛋白質(zhì)與纖維素的結(jié)合，釋放蛋白質(zhì)，提高蛋白質(zhì)的提取率。準(zhǔn)確稱取洗滌除雜后的黃酒糟濕堿3.00g，按1：8的比例加水，置于50水浴中，調(diào)pH值至5（用1mol /L NaOH 進(jìn)行調(diào)整）。按照酶量28u/g加入纖維素酶，水浴搖動(dòng)30min至結(jié)束

17、；反應(yīng)過程中不斷加堿，使反應(yīng)體系的pH值保持在設(shè)定值的0.1以內(nèi)。反應(yīng)結(jié)束后，在沸水浴中加熱 15 min 使酶失活。 4000 r/min 離心 10 min，棄上清，收集沉淀。最后的干燥過程。(2) 工藝流程準(zhǔn)確稱取處理后的酒糟3.00g加水調(diào)節(jié)合適的pH和溫度酶解滅酶（100 ， 15min）離心（4000r/min，10min）收集上清液UV分光光度法測(cè)定吸光度根據(jù)吸光度計(jì)算蛋白質(zhì)含量。2.2.2 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作由于酪氨酸、色氨酸殘基和苯丙氨酸中所含的苯環(huán)具有共軛雙鍵，蛋白質(zhì)分子具有吸收紫外光的特性，其最大吸收峰位于280nm附近（不同蛋白質(zhì)吸收波長(zhǎng)）。稍微不一樣）。在最大吸收峰

18、處，吸光度與蛋白質(zhì)含量成正比，其關(guān)系遵循朗伯-比爾定律。利用蛋白質(zhì)溶液的吸光值與其在一定波長(zhǎng)下的濃度成正比關(guān)系，可以測(cè)定蛋白質(zhì)的含量。本方法具有簡(jiǎn)便、靈敏、快速、選擇性高、易消除干擾、不消耗樣品、穩(wěn)定性好、對(duì)測(cè)定無干擾等優(yōu)點(diǎn)。測(cè)定蛋白質(zhì)溶液在 280 nm 處的吸光度是最常用的紫外吸收方法。許多蛋白質(zhì)在一定濃度和一定波長(zhǎng)下的吸光值都有文獻(xiàn)數(shù)據(jù)，根據(jù)這個(gè)吸光值可以更準(zhǔn)確地計(jì)算出蛋白質(zhì)濃度。如果找不到待測(cè)蛋白質(zhì)的吸光值，可選擇與待測(cè)蛋白質(zhì)的酪氨酸和色氨酸含量相近的蛋白質(zhì)作為標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)，采用標(biāo)準(zhǔn)曲線法測(cè)定。制備濃度為 1.0 mg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液。常用的標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)是牛血清白蛋白 (BSA)。

19、準(zhǔn)確稱取25 mg牛血清白蛋白粉，溶解于小燒杯中，加入25 mL容量瓶中，配制成1 mg/mL牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液。將得到的標(biāo)準(zhǔn)牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液分別分別吸取0.0mL、1.0mL、1.5mL、2.0mL、2.5mL、3.0mL、4.0mL分別于7支潔凈的4mL刻度試管中，分別加入各刻度試管中。加入4.0mL、3.0mL、2.5mL、2.0mL、1.5mL、1.0mL、0.0mL蒸餾水，搖勻，靜置6min，在280nm處測(cè)定吸光度。用對(duì)應(yīng)的蛋白質(zhì)濃度坐標(biāo)和對(duì)應(yīng)的吸光度值繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。2.2.3 單因素測(cè)試(1)酶添加量對(duì)蛋白提取率的影響準(zhǔn)確稱取處理后的酒糟3.00g，按料水比1：8加水，置于

20、50水浴中，調(diào)節(jié)pH至11（用1mol/L NaOH調(diào)節(jié)） ）。按酶用量500u/g、1000u/g、1500u/g、2000u/g、2500u/g加入堿性裂解蛋白酶，水浴搖晃2小時(shí)，反應(yīng)過程中不斷加酸或堿以維持反應(yīng)溶液的pH值在設(shè)定值是110.1左右。反應(yīng)結(jié)束后，在沸水浴中加熱15 min滅活酶，然后調(diào)節(jié)pH至7，以4000 r/min的速度離心10 min，收集上清液。用紫外分光光度法測(cè)定上清液的吸光度，然后計(jì)算蛋白質(zhì)含量，最后計(jì)算蛋白質(zhì)提取率。(2) pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響準(zhǔn)確稱取處理后的酒糟3.00克，按料水比1：8加水，水浴溫度保持在50，然后調(diào)節(jié)pH值分別為9、10、11 , 和

21、 12. 按酶量2000u/g加入堿性裂解蛋白酶，水浴振蕩2小時(shí)。反應(yīng)過程中不斷加入酸或堿，使反應(yīng)溶液的pH值保持在設(shè)定值0.1以內(nèi)。反應(yīng)結(jié)束后，在沸水浴中加熱15 min滅活酶，然后調(diào)節(jié)pH至7，以4000 r/min的速度離心10 min，收集上清液。用紫外分光光度法測(cè)定上清液的吸光度，然后計(jì)算蛋白質(zhì)含量，最后計(jì)算蛋白質(zhì)提取率。(3) 反應(yīng)溫度對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響準(zhǔn)確稱取處理后的酒糟3.00g，按料水比1：8加水，水浴溫度保持在50，然后調(diào)pH值至11（用1 mol/L 氫氧化鈉）。按加酶量2000u/g加入堿性裂解蛋白酶，在40、45、50、55水浴中搖晃2小時(shí)，期間連續(xù)加酸或堿反應(yīng)保持

22、反應(yīng)溶液的pH值。設(shè)定值為 110.1 左右。反應(yīng)結(jié)束后，在沸水浴中加熱15 min滅活酶，然后調(diào)節(jié)pH至7，以4000 r/min的速度離心10 min，收集上清液。用紫外分光光度法測(cè)定上清液的吸光度，然后計(jì)算蛋白質(zhì)含量，最后計(jì)算蛋白質(zhì)提取率。(4) 反應(yīng)時(shí)間對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響準(zhǔn)確稱取處理后的酒糟3.00g，按料水比1：8加水，水浴溫度保持在50，然后調(diào)pH值至11（用1 mol/L 氫氧化鈉）。按酶用量2000u/g加入堿性裂解蛋白酶，水浴搖動(dòng)1h、2h、3h、4h，反應(yīng)過程中不斷加入酸或堿，使反應(yīng)液pH值保持在設(shè)定值11 0.1。反應(yīng)結(jié)束后，在沸水浴中加熱15 min滅活酶，然后調(diào)節(jié)p

23、H至7，以4000 r/min的速度離心10 min，收集上清液。用紫外分光光度法測(cè)定上清液的吸光度，然后計(jì)算蛋白質(zhì)含量，最后計(jì)算蛋白質(zhì)提取率。(5) 固液比對(duì)蛋白提取率的影響準(zhǔn)確稱取加工好的酒糟3.00g，按料水比1: 8、1 : 12、1 : 16、1 : 20加水， 50水浴中保溫，然后將pH值調(diào)至11（用1mol/L的NaOH調(diào)節(jié)）。按酶量2000u/g加入堿性裂解蛋白酶，水浴搖動(dòng)2小時(shí)。反應(yīng)過程中不斷加入堿，使反應(yīng)溶液的pH值保持在設(shè)定值110.1。反應(yīng)結(jié)束后，在沸水浴中加熱15 min滅活酶，然后調(diào)節(jié)pH至7，以4000 r/min的速度離心10 min，收集上清液。用紫外分光光度

24、法測(cè)定上清液的吸光度，然后計(jì)算蛋白質(zhì)含量，最后計(jì)算蛋白質(zhì)提取率。2.2.4原料中總蛋白含量和蛋白提取率的計(jì)算原料中總蛋白質(zhì)含量采用微量凱氏定氮法測(cè)定。原理如下：將試樣與濃硫酸加熱，使含氮有機(jī)物分解生成氨（消解），氨與硫酸反應(yīng)生成硫酸銨。用強(qiáng)堿堿化分解放出氨，再通過水蒸氣蒸餾（蒸餾）將氨蒸入無機(jī)酸溶液中。然后用標(biāo)準(zhǔn)酸溶液滴定。滴定所用無機(jī)酸的量相當(dāng)于被測(cè)樣品中氨的量（滴定），可根據(jù)測(cè)定的氨量計(jì)算出樣品的氮含量。然后根據(jù)氮含量計(jì)算總蛋白質(zhì)含量?？偟鞍踪|(zhì)含量（%） =氮含量6.25100%蛋白質(zhì)提取率 (%) =2.2.5 正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)鑒于各因素之間的相互影響，在單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取加酶量、pH

25、、反應(yīng)溫度、反應(yīng)時(shí)間、料液比5個(gè)因素進(jìn)行正交實(shí)驗(yàn)，確定蛋白提取率被用作指標(biāo)。對(duì)結(jié)果進(jìn)行方差分析，得出最佳的提取工藝條件。3 結(jié)果與分析3.1 蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線圖1 牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)曲線根據(jù)數(shù)據(jù)，得到牛血清白蛋白標(biāo)準(zhǔn)溶液與吸光度的線性回歸方程為：y=1.8598x-0.0056其中x：280nm處的吸光度值； y：牛血清白蛋白濃度；經(jīng)計(jì)算，相關(guān)系數(shù)為：R =0.9994，回歸極顯著。因此，該方法可用于測(cè)定蛋白質(zhì)含量。3.2 原料中總蛋白質(zhì)含量酒糟粉經(jīng)水洗除雜、纖維素酶處理后，采用微量凱氏定氮法測(cè)定氮含量，進(jìn)一步計(jì)算總蛋白含量為39.60%。3.3 測(cè)試結(jié)果分析3.3.1 酶添加量對(duì)蛋白提取率的影響

26、圖2 酶添加量對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響從圖2可以看出，當(dāng)酶的加入量從500u/g增加到2000u/g時(shí)，蛋白提取率也穩(wěn)步提高。但當(dāng)酶的添加量超過2000u/g時(shí)，蛋白質(zhì)提取率的上升趨勢(shì)會(huì)減慢。原因是在底物濃度不斷被酶充分飽和之前，酶添加量的增加提高了堿性蛋白酶作用于酒糟中蛋白質(zhì)的能力。但當(dāng)酶濃度逐漸增加直至底物濃度不能飽和時(shí)，酶解程度變慢，提取率不再與之成比例增加。3.3.2 pH對(duì)蛋白質(zhì)提取率的影響圖3 pH對(duì)蛋白提取率的影響從圖 3 可以看出，當(dāng) pH 值小于 10 時(shí)，蛋白質(zhì)提取率隨著 pH 值的增加而增加。當(dāng)pH值為10時(shí)，蛋白質(zhì)提取率達(dá)到最大值，然后隨著pH值的升高而降低。 pH值在10

27、左右，蛋白提取率高，說明堿性蛋白酶在該區(qū)域具有較高的活性，低于或高于該區(qū)域酶活性都會(huì)降低。3.3.3 反應(yīng)溫度對(duì)蛋白提取率的影響圖4 反應(yīng)溫度對(duì)蛋白提取率的影響從圖4可以看出，在45 50范圍內(nèi)，隨著溫度的升高，蛋白質(zhì)提取率明顯提高；當(dāng)溫度為50時(shí)，蛋白質(zhì)提取率最高。溫度高于50后，蛋白質(zhì)提取率下降。原因可能是反應(yīng)溫度超過了其酶促反應(yīng)的最適溫度，導(dǎo)致蛋白質(zhì)變性和降解，降低了提取效率。因此，堿性裂解蛋白酶的最佳反應(yīng)溫度為4550。3.3.4 反應(yīng)時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響圖 5 反應(yīng)時(shí)間對(duì)蛋白提取率的影響從圖5可以看出，在反應(yīng)的前3小時(shí)，蛋白提取率隨著時(shí)間的延長(zhǎng)而穩(wěn)步上升； 3小時(shí)后，蛋白提取率緩慢

28、增加?？傊?小時(shí)蛋白質(zhì)的水解速度極快；當(dāng)溶液中積累一定量的多肽和氨基酸等水解產(chǎn)物時(shí)，蛋白質(zhì)產(chǎn)量的增加速度減慢。這是因?yàn)榈鞍踪|(zhì)水解是一種可逆反應(yīng)，這些物質(zhì)的積累會(huì)對(duì)酶解反應(yīng)產(chǎn)生一定的抑制作用。同時(shí)，高溫環(huán)境也會(huì)使大量酶失活。因此，正交試驗(yàn)中的反應(yīng)時(shí)間設(shè)定為3h。3.3.5 固液比對(duì)蛋白提取率的影響圖 6 固液比對(duì)蛋白提取率的影響從圖6可以看出，當(dāng)初始固液比為1:8時(shí)，蛋白提取率達(dá)到最大值，然后隨著加液率的增加，蛋白提取率繼續(xù)下降。因?yàn)楣桃罕冗^低時(shí)，反應(yīng)體系粘稠，流動(dòng)性差，酒糟與蛋白酶不能很好地結(jié)合，反應(yīng)不能充分進(jìn)行。當(dāng)固液比過高時(shí)，酶的相對(duì)濃度降低，與底物碰撞的概率大大降低。因此，最合適的固

29、液比為1：8 。3.3.6 正交試驗(yàn)在影響蛋白提取率的5個(gè)單因素中，固液比與蛋白提取率呈負(fù)相關(guān)，當(dāng)固液比為1:8時(shí)幾乎達(dá)到最大提取率。實(shí)際操作中發(fā)現(xiàn)，料液比過低時(shí)，反應(yīng)體系太稠，難以攪拌混合，體系分散不均勻，料液比不能選得太低了。但是，當(dāng)固液比過高時(shí)，不僅會(huì)降低反應(yīng)速率，而且會(huì)增加蛋白水解液的濃縮操作時(shí)間，增加生產(chǎn)成本和周期。因此，正交試驗(yàn)中固液比為1：8，不再進(jìn)行分析驗(yàn)證。 .根據(jù)以上分析，在單因素試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，采用正交表進(jìn)行試驗(yàn)，以蛋白提取率為指標(biāo)，研究四種酶的添加量（A）、pH（B )、溫度 (C) 和時(shí)間 (D)。影響因素對(duì)酒糟蛋白質(zhì)提取率的影響，以獲得最佳的因素水平組合。表 4 因子

30、水平選擇表等級(jí)因素添加酶量（A）酸堿度(B)反應(yīng)溫度（）響應(yīng)時(shí)間 (D)11600u/g10402小時(shí)21800u/g10.5453小時(shí)32000u/g11504小時(shí)表 5測(cè)試方案及測(cè)試結(jié)果計(jì)算表測(cè)試編號(hào) ABCD 萃取率 (%)1 1 1 1 1 36.912 1 2 2 2 31.233 1 3 3 3 34.834 2 1 2 3 35.695 2 2 3 1 37.206 2 3 1 2 34.297 3 1 3 2 47.408 3 2 1 3 32.639 3 3 2 1 44.64102.97 120 103.83 118.75107.18 101.06 111.56 112.9

31、2 T=334.82124.67 113.76 119.43 103.1534.32 40 34.61 39.5835.73 33.69 37.19 37.6441.56 37.92 39.81 34.387.24 6.31 5.2 5.2表 6 方差分析表變異來源自由程度平方和方差F值顯著性一個(gè)288.2844.1429.23乙262.131.0520.56C240.5620.2813.43D238.4219.2112.72錯(cuò)誤 e23.011.51由表5可以看出，在試驗(yàn)值范圍內(nèi)，通過數(shù)值比較可以得出，影響蛋白提取率的主次因素有4個(gè)：加酶量pH反應(yīng)溫度=反應(yīng)時(shí)間。通過比較 K 值，可以確定各

32、因素的最佳水平為 A B C D ，即：酶的加入量為 2000u/g，pH 為 10，反應(yīng)溫度為 50，反應(yīng)時(shí)間為2h。從表 6 的方差分析可以看出，在實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的水平上，只有酶的添加量和 pH 值是顯著的。本次測(cè)試的指標(biāo)是越大越好，即蛋白提取率越高。因此，酶的添加量應(yīng)為2000u/g，pH應(yīng)為10。對(duì)于反應(yīng)溫度和反應(yīng)時(shí)間不顯著的因素，可將單因素和正交試驗(yàn)的結(jié)果結(jié)合起來，堿性裂解蛋白酶的最適溫度應(yīng)在50左右。蛋白提取率會(huì)隨著反應(yīng)時(shí)間的增加而不斷提高，但需要考慮成本和操作方便性來選擇最佳水平。在設(shè)定的反應(yīng)溫度和pH下，反應(yīng)時(shí)間為2h時(shí)蛋白質(zhì)的提取率最高，該條件下蛋白質(zhì)的提取率為47.40%。因此，

33、總的來說，本實(shí)驗(yàn)的最佳條件應(yīng)該是：酶的加入量為2000u/g，pH值為10，反應(yīng)溫度為50，反應(yīng)時(shí)間為2h。4。結(jié)論本實(shí)驗(yàn)在對(duì)多種植物蛋白提取方法進(jìn)行研究比較的基礎(chǔ)上，為提高酒糟蛋白的提取率，首先采用水洗去除雜質(zhì)，再采用纖維素酶酶解進(jìn)行原料預(yù)處理。 ，然后使用酒糟蛋白酶。提取工藝路線。針對(duì)黃酒糟組織致密、粗纖維含量高的特點(diǎn)，采用堿切蛋白酶酶解植物蛋白，將蛋白質(zhì)分解成氨基酸和分子量小但溶解性好的短肽。通過對(duì)各種操作因素和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的合理研究分析，經(jīng)過單因素試驗(yàn)和正交試驗(yàn)，得出以下結(jié)論：酶添加量為2000u/g時(shí)，pH值為10，溫度為50 C、反應(yīng)2h條件下，蛋白提取率最高可達(dá)47.40%。同時(shí)，各

34、因素對(duì)酒糟蛋白提取率的影響是相互關(guān)聯(lián)、相互制約的，其影響規(guī)律在不同層次上差異很大，呈非線性函數(shù)關(guān)系。因此，我們有必要在實(shí)際生產(chǎn)和研究中找到各個(gè)運(yùn)行參數(shù)的最佳條件，并通過對(duì)各個(gè)運(yùn)行因素的合理研究分析和實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)來獲得最大的效益。參考1 李建榮.黃酒行業(yè)現(xiàn)狀及發(fā)展方向J.釀酒，2000,32(1):2-4。2郭軍.中國(guó)黃酒產(chǎn)業(yè)研究報(bào)告J.中國(guó)釀造，2005，（4）：1-5。3 建美.蛋白酶法提取酒糟的工藝研究D.中國(guó)科學(xué)院冶金研究所， 2007 .4 華，石家輝酒糟氨基酸組成和脂質(zhì)組成分析J.農(nóng)業(yè)科學(xué)，2009,37(34):1742-1743。5 陶。用米酒糟生產(chǎn)醋J.科技情報(bào), 2000, 29

35、(2): 2-3.6 顧海先，周建明。酒糟酶解制備特種鮮醬油的研究J.中國(guó)調(diào)味品，2003，（3）：10-12。7 國(guó)君利用黃酒糟生產(chǎn)“香糯米”J.釀造科技，2003，（2）：108-109。8 王素平.米黃酒糟酵母蛋白飼料的研制、中試及產(chǎn)品應(yīng)用D.江南大學(xué)，2005.9 王建國(guó)，錢飛，易水明酒糟中復(fù)合氨基酸的試制J.釀造科技，2001（3）：65-66。10 Marshall W. G , Wordsworth JI Rice Science and Technology M.紐約： Marcel Dekker , Inc. 1994, 237-259 。11 志軍，陸寧華，明水解蛋白的研究

36、與應(yīng)用J食品工業(yè)，2003（10）：36-38。12 大衛(wèi) W J 湯普森。響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)J食品加工與保存雜志，1982，18(6)：155-158。13左楠楠，王曉偉，金海如。酒糟蛋白的酶法提取研究J農(nóng)業(yè)科學(xué), 2012, 40(12).14 濱田J.S.利用蛋白酶增強(qiáng)米糠蛋白的增溶作用J.食品生化， 1998，23：307-321。15 元.磁性聚合物微球的制備及應(yīng)用D.科技大學(xué)，2010.16 嚴(yán).副豬嗜血桿菌神經(jīng)氨酸酶理化性質(zhì)及免疫原性D.農(nóng)業(yè)大學(xué)，2010 .17 建中，熊亞紅，翁麗萍生物過程的優(yōu)化N。大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版），2002，（6）132-136。至忙了將近兩個(gè)月，我的畢業(yè)論文終于要告一段落了。畢業(yè)論文之際，我要特別感謝我的導(dǎo)師，他盡管肩負(fù)著教學(xué)和科研的重任 HYPERLINK %20%20%20%20:/jiaoxuegongzuozongjie.unjs%20%20%20%20/ ，仍然在百忙之中抽空說出自己的心聲，真摯的情意盡在認(rèn)真的教導(dǎo)。作為一名優(yōu)秀、負(fù)責(zé)、經(jīng)驗(yàn)豐富的老師，無論是