《土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)》導(dǎo)學(xué)案答案說(shuō)課講解

1、 5/5土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)導(dǎo)學(xué)案答案說(shuō)課講解 土壤中分解尿素的細(xì)菌的分離與計(jì)數(shù)導(dǎo)學(xué)案答案 一、研究培養(yǎng)基對(duì)微生物的選擇作用 1.篩選菌株 (1)自然界中目的菌株的篩選 原理：根據(jù)目的菌株對(duì)生存環(huán)境的要求，到相應(yīng)的環(huán)境中去尋找。 實(shí)例：能產(chǎn)生耐高溫的Taq DNA聚合酶的Taq細(xì)菌就是從熱泉中篩選出來(lái)的。 (2)實(shí)驗(yàn)室中目的菌株的篩選 原理：人為提供有利于目的菌株生長(zhǎng)的條件(包括營(yíng)養(yǎng)、溫度、pH等)，同時(shí)抑制或阻止其他微生物生長(zhǎng)。 實(shí)例：從土壤中篩選能分解尿素的細(xì)菌。 方法：利用選擇培養(yǎng)基進(jìn)行微生物的篩選。 2.選擇培養(yǎng)基 (1)概念：允許特定種類(lèi)的微生物生長(zhǎng)，同時(shí)抑制或阻止其他種

2、類(lèi)微生物生長(zhǎng)的培養(yǎng)基。 (2)舉例：篩選土壤中分解尿素的細(xì)菌的選擇培養(yǎng)基是以尿素為唯一氮源，按物理性質(zhì)歸類(lèi)為固體培養(yǎng)基。 1.篩選分解尿素的細(xì)菌的選擇培養(yǎng)基 下面是本課題使用的培養(yǎng)基的配方，請(qǐng)分析并回答下列問(wèn)題： KH2PO4 1.4 g Na2HPO4 2.1 g MgSO47H2O 0.2 g 葡萄糖10.0 g 尿素 1.0 g 瓊脂15.0 g 將上述物質(zhì)溶解后，用蒸餾水定容到1 000 mL (1)該培養(yǎng)基的配方中，為微生物的生長(zhǎng)提供碳源和氮源的分別是什么物質(zhì)？ 答案碳源是葡萄糖，氮源是尿素。 (2)分離分解尿素的細(xì)菌的選擇培養(yǎng)基是如何進(jìn)行選擇的？ 答案該選擇培養(yǎng)基的配方中，尿素是培

3、養(yǎng)基中的唯一氮源，因此，只有能夠利用尿素的微生物才能夠生長(zhǎng)。 (3)為什么只有能分解尿素的微生物才能在該培養(yǎng)基上生長(zhǎng)？ 答案分解尿素的微生物能合成脲酶，而脲酶可將尿素分解成氨，從而為微生物提供氮源。 2.設(shè)計(jì)對(duì)照實(shí)驗(yàn) (1)如何設(shè)計(jì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證該選擇培養(yǎng)基的確篩選到了能分解尿素的細(xì)菌？ 答案增設(shè)牛肉膏蛋白胨基礎(chǔ)培養(yǎng)基并進(jìn)行涂布平板操作，如果牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基上的菌落數(shù)明顯多于選擇培養(yǎng)基上的菌落數(shù)，則說(shuō)明選擇培養(yǎng)基的確起到了篩選能分解尿素的細(xì)菌的作用。 (2)如何設(shè)計(jì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證所用的選擇培養(yǎng)基沒(méi)有受到污染？ 答案設(shè)置一個(gè)未涂布平板的能篩選分解尿素的細(xì)菌的選擇培養(yǎng)基。 歸納總結(jié)選擇培養(yǎng)基的分類(lèi)

4、(1)利用營(yíng)養(yǎng)缺陷型選擇培養(yǎng)基進(jìn)行的選擇培養(yǎng)：通過(guò)控制培養(yǎng)基的營(yíng)養(yǎng)成分，使?fàn)I養(yǎng)缺陷型微生物不能正常生長(zhǎng)。 (2)利用化學(xué)物質(zhì)進(jìn)行的選擇培養(yǎng)：在完全培養(yǎng)基中加入某些化學(xué)物質(zhì)，利用加入的化學(xué)物質(zhì)抑制某些微生物的生長(zhǎng)，同時(shí)選擇所需的微生物。 (3)利用培養(yǎng)條件進(jìn)行的選擇培養(yǎng)：改變微生物的培養(yǎng)條件(如高溫、特殊pH等)，篩選特定微生物。 1.下列有關(guān)微生物篩選的敘述中，不正確的是() A.用全營(yíng)養(yǎng)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基篩選大腸桿菌 B.用高NaCl的培養(yǎng)基篩選抗鹽突變菌株 C.含酚紅的尿素培養(yǎng)基篩選鑒別出分解尿素的菌株 D.利用高溫條件篩選耐熱的Taq細(xì)菌 答案 A 解析全營(yíng)養(yǎng)牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基常用于大腸

5、桿菌的培養(yǎng)，該培養(yǎng)基對(duì)微生物無(wú)選擇作用，A項(xiàng)錯(cuò)誤；抗鹽突變菌株具有耐高鹽的能力，因此可以利用高NaCl的選擇培養(yǎng)基進(jìn)行選擇培養(yǎng)，B項(xiàng)正確；分解尿素的菌株能將尿素分解成氨，使培養(yǎng)基pH升高，因此可以利用含酚紅的尿素培養(yǎng)基篩選鑒別出分解尿素的菌株，C項(xiàng)正確；利用高溫條件可以篩選耐熱的Taq 細(xì)菌，D項(xiàng)正確。 2.下表是微生物培養(yǎng)基的成分。下列有關(guān)說(shuō)法錯(cuò)誤的是() 編號(hào) 成分(NH4)2SO4KH2PO4FeSO4CaCl2H2O 含量/g 0.4 4.0 0.5 0.5 100 mL A.此培養(yǎng)基可用來(lái)培養(yǎng)自養(yǎng)型微生物 B.此表中的營(yíng)養(yǎng)成分共有三類(lèi)，即水、無(wú)機(jī)鹽、氮源 C.若除去，此培養(yǎng)基可培養(yǎng)圓

6、褐固氮菌 D.培養(yǎng)基中若加入氨基酸，則它可充當(dāng)碳源、氮源和生長(zhǎng)因子 答案 C 解析分析題表可知，該培養(yǎng)基成分中含有水、無(wú)機(jī)鹽、氮源，但不含含碳有機(jī)物，可用來(lái)培養(yǎng)自養(yǎng)型微生物，A、B項(xiàng)正確；圓褐固氮菌同化類(lèi)型為異養(yǎng)型，培養(yǎng)基中必須存在含碳有機(jī)物，所以該培養(yǎng)基不能用來(lái)培養(yǎng)圓褐固氮菌，C項(xiàng)錯(cuò)誤。 方法技巧選擇培養(yǎng)基的常見(jiàn)類(lèi)型 (1)分離微生物所用的選擇培養(yǎng)基一定是固體培養(yǎng)基，因?yàn)榫渲荒茉诠腆w培養(yǎng)基上形成。 (2)常見(jiàn)的選擇培養(yǎng)基 加入青霉素可以分離出酵母菌和霉菌。 加入高濃度的食鹽可得到金黃色葡萄球菌。 無(wú)氮源培養(yǎng)基可以分離固氮微生物。 以石油為唯一碳源的培養(yǎng)基，可以分離能消除石油污染的微生物。

7、將培養(yǎng)基放在高溫環(huán)境中培養(yǎng)，可以分離耐高溫的微生物。 二、進(jìn)行微生物數(shù)量的測(cè)定 1.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目 (1)方法：統(tǒng)計(jì)樣品中微生物數(shù)量的方法有稀釋涂布平板法和顯微鏡直接計(jì)數(shù)法。常用來(lái)統(tǒng)計(jì)活菌數(shù)目的方法是稀釋涂布平板法。 (2)統(tǒng)計(jì)依據(jù)：當(dāng)樣品的稀釋度足夠高時(shí)，培養(yǎng)基表面生長(zhǎng)的一個(gè)菌落，來(lái)源于樣品稀釋液中 的一個(gè)活菌。通過(guò)統(tǒng)計(jì)平板上的菌落數(shù)，就能推測(cè)出樣品中大約含有多少活菌。 (3)操作 設(shè)置重復(fù)組，增強(qiáng)實(shí)驗(yàn)的說(shuō)服力與準(zhǔn)確性。 為保證結(jié)果準(zhǔn)確，一般選擇菌落數(shù)在30300的平板進(jìn)行計(jì)數(shù)。 統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)往往比活菌實(shí)際數(shù)目低。 (4)計(jì)算公式：每克樣品中的菌株數(shù)(CV)M，其中C代表某一稀釋度下平板上生長(zhǎng)

8、的平均菌落數(shù)，V代表涂布平板時(shí)所用的稀釋液的體積(mL)，M代表稀釋倍數(shù)。 2.設(shè)置對(duì)照 (1)對(duì)照實(shí)驗(yàn)：是指除了被測(cè)試條件以外，其他條件都相同的實(shí)驗(yàn)。 (2)主要目的：排除實(shí)驗(yàn)組中非測(cè)試因素對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的影響，提高實(shí)驗(yàn)結(jié)果的可信度。例如，為了確認(rèn)培養(yǎng)基是否被雜菌污染，需以不進(jìn)行接種的培養(yǎng)基培養(yǎng)作為空白對(duì)照。 3.實(shí)驗(yàn)操作流程 (1)土壤取樣 取樣原因：土壤有“微生物的天然培養(yǎng)基”之稱，同其他生物環(huán)境相比，土壤中的微生物數(shù)量最大，種類(lèi)最多。 土壤要求：富含有機(jī)質(zhì)，pH接近中性且潮濕。 取樣部位：距地表約38 cm的土壤層。 (2)樣品稀釋 稀釋原因：樣品的稀釋程度直接影響平板上生長(zhǎng)的菌落數(shù)目。

9、稀釋標(biāo)準(zhǔn)：選用一定稀釋范圍的樣品液進(jìn)行培養(yǎng)，以保證獲得菌落數(shù)在30300之間，便于計(jì)數(shù)。 (3)微生物的培養(yǎng)與觀察 培養(yǎng)：根據(jù)不同微生物的需要，控制適宜的培養(yǎng)溫度和培養(yǎng)時(shí)間。 觀察 a.觀察方法：每隔24 h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目，最后選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果。 b.菌落的特征：包括菌落的形狀、大小、隆起程度和顏色等。 (4)菌種鑒定 原理：細(xì)菌合成的脲酶將尿素分解成氨，使培養(yǎng)基的堿性增強(qiáng)。 方法：以尿素為唯一氮源的培養(yǎng)基中加入酚紅指示劑，培養(yǎng)某種細(xì)菌后，若指示劑變紅，可初步鑒定該種細(xì)菌能夠分解尿素。 4.操作提示 (1)無(wú)菌操作 取土樣的用具在使用前都需要滅菌。 實(shí)驗(yàn)操作均應(yīng)在火焰旁進(jìn)行。

10、 (2)做好標(biāo)記：本實(shí)驗(yàn)使用的平板和試管比較多，為避免混淆，使用前應(yīng)標(biāo)明培養(yǎng)基的種類(lèi)、培養(yǎng)日期以及平板上培養(yǎng)樣品的稀釋度等。 (3)制定計(jì)劃：對(duì)于耗時(shí)較長(zhǎng)的生物實(shí)驗(yàn)，要事先制定計(jì)劃，以便提高工作效率。 下面是土壤中尿素分解菌的分離與計(jì)數(shù)的實(shí)驗(yàn)流程示意圖，請(qǐng)結(jié)合教材提供的資料分析回答下列問(wèn)題： 1.實(shí)驗(yàn)流程 試寫(xiě)出分離土壤中分解尿素的細(xì)菌的實(shí)驗(yàn)流程(用文字和箭頭表示)。 答案土壤取樣樣品稀釋取樣涂布微生物培養(yǎng)觀察并記錄結(jié)果細(xì)菌計(jì)數(shù)。 2.統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)目 甲、乙兩位同學(xué)用稀釋涂布平板法測(cè)定同一土壤樣品中的細(xì)菌數(shù)。在對(duì)應(yīng)稀釋倍數(shù)為106的培養(yǎng)基中，得到以下兩種統(tǒng)計(jì)結(jié)果。 (1)甲同學(xué)在該濃度下涂布了一

11、個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)為230，該同學(xué)的統(tǒng)計(jì)結(jié)果是否真實(shí)可靠？為什么？ 答案不真實(shí)。為增加實(shí)驗(yàn)的說(shuō)服力與準(zhǔn)確性，應(yīng)設(shè)置重復(fù)實(shí)驗(yàn)，在同一稀釋度下涂布3個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)結(jié)果后計(jì)算平均值。 (2)乙同學(xué)在該濃度下涂布了3個(gè)平板，統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)分別為21、212、256，該同學(xué)將21舍去，然后取平均值。該同學(xué)對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果的處理是否合理？為什么？ 答案不合理。微生物計(jì)數(shù)時(shí)，如果實(shí)驗(yàn)中出現(xiàn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)的結(jié)果不一致的情況，應(yīng)分析實(shí)驗(yàn)過(guò)程中可能的影響因素，找出差異的原因，而不能簡(jiǎn)單地舍棄后進(jìn)行計(jì)數(shù)。 (3)某同學(xué)在三種稀釋度下吸取0.1 mL的菌液涂布平板，統(tǒng)計(jì)菌落數(shù)，得到以下的數(shù)據(jù)，試計(jì)算1 g樣品的活菌數(shù)。 平板 平板

12、1 平板2 平板3 稀釋度 104320 360 356 105212 234 287 10621 23 18 答案105的稀釋度下取0.1 mL涂布的三個(gè)平板上的菌落數(shù)在30300之間，計(jì)算其平均值為(212234287)/3244。進(jìn)一步可以換算出1 g樣品中活菌數(shù)為(2440.1)1052.44108個(gè)。 (4)為什么統(tǒng)計(jì)的菌落數(shù)比活菌的實(shí)際數(shù)目低？ 答案當(dāng)兩個(gè)或多個(gè)細(xì)菌連在一起時(shí)，平板上觀察到的只是一個(gè)菌落。 3.對(duì)照實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)的分析 分析教材P22“設(shè)置對(duì)照”中的實(shí)例，探討下列問(wèn)題： (1)在A同學(xué)確定自己操作無(wú)誤的情況下，A同學(xué)得出的菌落數(shù)多于其他同學(xué)的原因可能有哪兩種？ 答案可能是

13、他選擇的土壤樣品不同于其他同學(xué)；也可能是培養(yǎng)基受到了污染或操作失誤。 (2)如何設(shè)計(jì)對(duì)照實(shí)驗(yàn)幫助A同學(xué)排除上述兩個(gè)可能影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果的因素？ 答案其他同學(xué)用與A同學(xué)一樣的土樣進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，如果結(jié)果與A同學(xué)一致，則證明A同學(xué)操作無(wú)誤；如果結(jié)果不同，證明A同學(xué)存在操作失誤或培養(yǎng)基的配制有問(wèn)題；將A同學(xué)配制的培養(yǎng)基在不加土樣的情況下培養(yǎng)作為空白對(duì)照，以判斷培養(yǎng)基是否受到污染。 4.微生物數(shù)量測(cè)定的實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) (1)為什么分離不同的微生物要采用不同的稀釋度？ 答案土壤中各種微生物的數(shù)量是不同的，為獲得不同類(lèi)型的微生物，就需要按不同的稀釋度進(jìn)行分離。 (2)本實(shí)驗(yàn)中應(yīng)如何統(tǒng)計(jì)培養(yǎng)基上生長(zhǎng)的菌落數(shù)？ 答案每隔24 h統(tǒng)計(jì)一次菌落數(shù)目，選取菌落數(shù)目穩(wěn)定時(shí)的記錄作為結(jié)果。 (3)實(shí)驗(yàn)中的無(wú)菌操作主要有哪些？ 答案培養(yǎng)基、錐形瓶、試管、鏟子、信封等，需要進(jìn)行滅菌。稱取土壤要在火焰旁進(jìn)行。稀釋土壤溶液的每一步操作都要在火焰旁進(jìn)行。 歸納總結(jié)分離尿素分解菌操作中的注意事項(xiàng) (1)在實(shí)驗(yàn)操作中，每個(gè)步驟都要注意無(wú)菌操作，以防培養(yǎng)基被污染，影響實(shí)驗(yàn)效果。 (2)樣品