酶生物傳感器市公開課金獎市賽課一等獎課件

1、1第四章 酶生物傳感器 Enzyme Biosensor 一、酶本質與特征 酶本質 酶是生物體內產生、含有催化活性一類蛋白質。 依據化學組成份為兩大類，即單純蛋白酶與結合蛋白酶。 依據酶催化反應類型分為氧化還原酶、轉移酶、水解酶、異構酶等。 第1頁2 酶基本特征 酶高效催化性 酶催化效率通常比普通催化劑高106-1012倍。酶之所以能高效催化，是經過降低反應所需活化能實現。 第2頁3 酶高度特異性 酶不但含有普通催化劑加緊反應速度作用，而且含有高度特異性。 絕對特異性 相對特異性 立體異構特異性第3頁4酶促反應動力學 酶促反應動力學是研究酶反應速度及各種原因對酶反應速度影響科學。 主要影響原因

2、包含有：底物濃度、酶濃度、 pH值、溫度、抑制劑與激活劑等。 第4頁5 酶動力學測定是初速度，是指酶在反應過程中底物初始濃度被消耗在5%以內速度。目標是排除酶反應過程中出現各種干擾原因，方便測得準確酶反應速度。 第5頁6底物濃度對酶促反應速度影響 第6頁7酶濃度對酶促反應速度影響 若底物初始濃度固定時，酶反應速度與酶濃度呈線性關系。第7頁8溫度對酶促反應速度影響 每一個酶催化反應都有適宜溫度范圍和最適溫度。第8頁9pH對酶促反應速度影響 每一個酶都有適宜pH值范圍和最適pH值。在一定pH下，酶促反應含有最高反應速度，此pH稱為該酶最適pH。 第9頁10第10頁11抑制劑、激活劑對酶促反應速度影

3、響 凡能降低酶活性甚至使酶完全失活物質稱為抑制劑，抑制劑種類很多，包含藥品、抗生素、毒物、抗代謝物以及酶促反應產物等。第11頁12 凡能激活酶活性物質，均稱激活劑。一些酶必須有激活劑存在，才能進行酶促反應。激活劑大部分為一些無機離子，也有一些有機分子。 第12頁13二、酶傳感器 酶傳感器是應用固定化酶作為敏感元件與各種信號轉換器組合而成生物傳感器。 依據信號轉換器類型，酶傳感器大致可分為酶電極、酶場效應管傳感器、酶熱敏電阻傳感器、酶壓電晶體型、光纖光學型等。 第13頁14 傳感器類型第14頁154.1 酶電極傳感器 Enzyme electrode sensor 酶電極是由固定化酶與電流型電極

4、或電位型電極組合而成生物傳感器。 含有酶分子識別和選擇催化功效，又有電化學電極響應快、操作簡便特點，能快速測定試液中某一給定化合物濃度，且需極少許樣品。 第15頁16電流型酶電極 電流型酶電極是將酶促反應產生物質在電極上發(fā)生氧化或還原反應產生電流作為測量信號，在一定條件下，利用測得電流信號與被測物活度或濃度函數關系，來測定樣品中某一生物組分活度或濃度。第16頁17制作生物傳感器最慣用是氧化酶： 底物+O2 產物+H2O2第17頁18 基礎電極可采取氧、過氧化氫電極，還可采取近年開發(fā)介體修飾炭、鉑、鈀和金等固體電極或介體修飾電極。第18頁19 氧電極：是一個經過測定電解電流來測定溶液中氧含量電解

5、池。 工作時，在鉑陰極和Ag陽極之間施加0.6V電壓。當E=-0.2V時電極開始電解，產生還原電流，其還原反應式為：第19頁使用最多是封閉式Clark氧電極第20頁21 鉑電極與Ag電極組合在一起置于參比溶液中，與被測溶液之間用透氧膜隔開。被測溶液中溶解氧經過膜擴散到電解質溶液薄層，再擴散到鉑電極表面進行還原產生電流。第21頁H2O2電極H2O2電極基本測量電路和電壓-電流曲線 第22頁 兩極間外加一定電壓，實際測量時，外加電壓控制在電壓-電流曲線平滑部分，即0.7-0.9V，此時輸出電流就與濃度成百分比。陽極反應陰極反應 第23頁24第24頁251.葡萄糖傳感器 葡萄糖傳感器是研究最早、開發(fā)

6、最成熟并已市場化生物傳感器，即血糖儀。各種型號血糖儀產品第25頁26（1）早期葡萄糖傳感器 早期葡萄糖傳感器是由葡萄糖氧化酶膜和電化學電極組成。在電化學電極透氣膜上固定葡萄糖氧化酶。第26頁27當葡萄糖溶液與酶膜接觸時，發(fā)生以下反應：第27頁28故葡萄糖濃度測試方法有三種： 生成葡萄糖酸 消耗氧 生成H2O2第28頁29測量葡萄糖酸葡萄糖傳感器： pH電極和離子敏場效應管測定葡萄糖酸量來計算樣品中葡萄糖含量，最低檢測限為10-3 molL，靈敏度較低；第29頁測量氧消耗量葡萄糖傳感器：30 Clark氧電極用于測定酶促反應中氧消耗量(電流降低量)來計算樣品中葡萄糖含量，最低檢測限為10-4 m

7、olL 。第30頁31 葡萄糖氧化產生H2O2， H2O2經過選擇性透氣膜，在Pt電極上氧化，葡萄糖含量與生成電流成正比，由此可測出葡萄糖濃度。 檢測H2O2方法本底電流小，靈敏度高，其最低檢出限為10-8molL。測量H2O2生成量葡萄糖傳感器：第31頁32（2）改進葡萄糖傳感器 為消除環(huán)境中氧對測定干擾，用四硫富瓦烯、二茂鐵等輕易在電極上氧化還原介體來代替氧電子傳遞作用。電子介體是酶氧化還原活性中心與電極表面之間電子傳遞中介物，在電流型酶電極中起著關鍵性作用。 各種電子傳遞介體使用，使得電流型酶傳感器響應速度、檢測靈敏度和選擇性都得到了很大提升。第32頁33 方法：將葡萄糖氧化酶和電子介體

8、同時包埋于聚合物膜中，或直接修飾于電極表面組成葡萄糖酶傳感器。第33頁34 在葡萄糖氧化酶（ ）催化下，葡萄糖被氧化為葡萄糖酸，再由二茂鐵離子將還原型葡萄糖氧化酶（ ）氧化為氧化型葡萄糖氧化酶（ ），然后二茂鐵在電極上氧化成二茂鐵離子，經過二茂鐵在電極上產生氧化電流來實現葡萄糖含量檢測。第34頁35介體傳感器特點：僅用較低電壓就能使介體氧化。傳感器對氧不敏感，能在缺氧和氧濃度 改變條件下使用。二茂鐵離子與還原GOD之間電子傳遞 快，電極響應快速。第35頁36 采取場效應晶體管和微電極做換能器，以縮小傳感器體積； 利用電子技術、改進信號放大和顯示方法，使其易于商品化； 改進采樣方法，使患者使用方

9、便或更易于臨床應用。 最主要改進是使用化學電子傳遞中間介體代替作為自然電子受體氧，使酶催化反應不再受到溶解氧含量制約。第36頁37（3）血糖儀測試片血糖儀測試片 第37頁38手表式葡萄糖傳感器第38頁第39頁40 手表式無創(chuàng)血糖儀是近年來出現一個無創(chuàng)、無痛，能連續(xù)測定血糖設備。它經過電化學傳感器和電滲透原理來檢測皮下組織液中葡萄糖濃度，無需針刺采血。 手表式血糖儀測定是組織間液葡萄糖值，所以要略滯后于指血血糖值。 第40頁41(2)乳酸電極 血液中乳酸濃度是反應人體體力消耗程度主要指標。在體育運動訓練中乳酸檢驗是極為必要，國際上乳酸傳感器已經有成熟商品儀器。第41頁第42頁43 還可采取介體修

10、飾方法制備乳酸傳感器。 在電極上滴介體四硫富瓦烯(TTF)漿液，晾干后，將乳酸氧化酶固定在該電極表面修飾層上面，即組成乳酸傳感器。第43頁44第44頁45 在乳酸氧化酶催化下，乳酸被氧化為丙酮酸，再由四硫富瓦烯離子將還原型乳酸氧化酶氧化為氧化型乳酸氧化酶，然后四硫富瓦烯在電極上氧化成四硫富瓦烯離子，經過四硫富瓦烯在電極上產生氧化電流來實現乳酸含量檢測。第45頁46(3)膽固醇電極 膽固醇電極是一個用于臨床測定血清膽固醇含量電流型酶傳感器。血液中膽固醇約有23以酯型存在，13以游離型存在。第46頁 自然界中膽固醇主要存在于動物性食物之中，植物中沒有膽固醇。 獸肉膽固醇含量高于禽肉，肥肉高于瘦肉，

11、貝殼類和軟體類高于普通魚類，蛋黃、魚子、動物內臟膽固醇含量非常高。 第47頁降低膽固醇食物： 含膳食纖維豐富食物 VC 與 VE 飲酒可能使血中高密度脂蛋白升高，加強防治高膽固醇血癥作用。葡萄酒較適當，但必須嚴格限制攝入量。 第48頁49 膽固醇電極是一個用于臨床測定血清膽固醇含量電流型酶傳感器。結合型酶電極第49頁50 依據反應過程中消耗氧，產生過氧化氫，用對應電極組成膽固醇傳感器測定電流改變量，在一定條件下，電流改變量與膽固醇濃度呈線性相關。第50頁51(4）肌酸和肌酸酐電極脫水肌酸肌酸酐第51頁 血清肌酸肝含量測定是衡量腎功效一個很好基準。 血清肌酸酐濃度不會因食物種類而受影響，所以做為

12、判斷腎臟機能依據較血清尿素可靠。 血清肌酸酐濃度與肌肉量相關，所以肌肉多排放尿肌酸酐濃度會比肌肉少多。 第52頁53第53頁54 肌酸和肌酸酐微傳感器第54頁55（5）磷酸鹽電極佝僂病軟骨病第55頁56葡萄糖-6-磷酸鹽葡萄糖 + 磷酸酸性磷酸酯酶葡萄糖 + O2葡萄糖酸 + H2O2葡萄糖氧化酶第56頁57（6）淀粉電極淀粉葡萄糖淀粉酶葡萄糖 + O2葡萄糖酸 + H2O2葡萄糖氧化酶第57頁58（7）乙醇電極CH3CH2OH 可用乙醇來制造醋酸、飲料、香精、染料、燃料等。 醫(yī)療上也慣用體積分數為70-75%乙醇作消毒劑等。 第58頁酒后駕駛飲酒駕車：指駕駛員血液中酒精含量大于或等于20 m

13、g/100 mL小于80 mg/100 mL駕駛行為。 350 mL(約相當于1小瓶)啤酒或半兩白酒(20 mL)第59頁醉酒駕車：指駕駛員血液中酒精含量大于或等于80 mg/100 mL駕駛行為。 1400 mL(約相當于3瓶500 mL)啤酒或一兩半白酒(80mL) 第60頁C2H5OH + NAD+CH3CHO + NADH醇脫氫酶NADH + Fe(CN)64-NAD+ + Fe(CN)63- + H+ + e-第61頁62（二）電位型酶電極 電位型酶電極是將酶促反應所引發(fā)物質量改變轉變成電位信號輸出，電位信號大小與底物濃度對數值呈線性關系。 第62頁電位型酶電極所用基礎電極是對某種離

14、子有選擇性或對氣體有選擇性電極離子選擇性電極氣敏電極第63頁64第64頁 1773年，伊萊爾羅埃爾（Hilaire Rouelle）發(fā)覺尿素。 1828年，德國化學家弗里德里希維勒首次使用無機物質氰酸氨（由氯化銨和氯酸銀反應制得）與硫酸銨人工合成了尿素。 弗里德里希維勒（Friedrich Wohler）尿素電極 第65頁尿素分子模型增高：急性或慢性腎小球腎炎、腎功效衰竭、尿路阻塞、尿路腫瘤、高蛋白質飲食等。減低：妊娠后期、蛋白質攝入不足、營養(yǎng)不良等。第66頁67 尿素在脲酶作用下發(fā)生水解反應可用氨氣敏電極、二氧化碳電極等作為基礎電極測定尿素含量。 第67頁（2）草酸電極草酸（乙二酸）結構式

15、維生素C代謝 甘氨酸代謝 草酰乙酸水解 異檸檬酸降解 食物攝入：菠菜、茶葉 生物體內草酸起源：第68頁草酸 草酸脫羧酶2CO2 + 甲酸第69頁（3）腺苷電極 參加心肌能量代謝 擴張血流量 合成ATP、腺苷酸主要中間體第70頁腺苷腺嘌呤脫氨基酶肌苷 + NH3第71頁（4）苯丙氨酸電極 哺乳動物必需氨基酸 是甜味劑阿斯巴甜主要原料第72頁苯丙氨酸苯丙氨酸胺裂解酶反式肉桂酸鹽+ NH3第73頁744.2 酶場效應晶體管傳感器(ENFET) ENFET將酶膜復合在ISFET柵極。 測量時，酶催化作用使待測分子反應生成ISFET能夠響應離子。 第74頁ISFET工作原理第75頁76 敏感膜與溶液界面

16、產生膜電位，該電位疊加在柵壓上，引發(fā)場效應管漏電流改變。依據能斯特方程，膜電位大小與溶液中離子活度相關，即:第76頁77（一）葡萄糖-FET 葡萄糖-FET是由對H+ 敏感ISFET和固定在其柵極上葡萄糖氧化酶膜組成。第77頁78 酶催化底物反應時，生成葡萄糖酸根、H+ 和過氧化氫，造成酶膜附近pH值改變，且pH改變量與葡萄糖含量相關。 溶液中H+濃度改變，離子敏感膜與溶液界面膜電位發(fā)生改變，該電位疊加在柵源電壓上，柵源電壓改變與溶液中pH值改變量成線性關系。葡萄糖-FET工作原理：第78頁 為提升葡萄糖-FET工作性能和測量精度，可采取兩個pH敏感場效應管組成差動式結構。雙柵極酶-FET傳感

17、器第79頁80 一個FET柵極固定葡萄糖氧化酶膜，作為工作FET；另一個FET柵極上沒有酶膜，作為參比FET。將2個FET接到差動放大器上，干擾原因被消除，使輸出電壓只對葡萄糖響應，所以輸出電壓改變能夠反應葡萄糖含量改變。第80頁81（二）尿素-FET 尿素-FET是由H+-ISFET和脲酶膜組成，其原理是利用pH-FET檢測脲酶水解尿素時溶液pH發(fā)生改變。 第81頁 第82頁83 尿素傳感器也可采取差動結構，使用兩個FET，一個是固定有尿素酶FET ，另一個則是沒有固定尿素酶FET，作為參比FET，利用運算放大器組成反饋電路。 Ag/AgCl電極可使溶液電位保持一定。第83頁84第84頁85

18、 測定時因為脲酶催化尿素反應時造成溶液中pH發(fā)生改變，從而造成溶液-界面上界面電位改變，經差動放大器后，輸出電壓與待測溶液尿素濃度相關。第85頁86其它應用： 青霉素-FET L-谷氨酸-FET傳感器第86頁874.3 酶熱敏電阻傳感器 酶熱敏電阻傳感器是由固定化酶和熱敏電阻組合而成。 用酶熱敏電阻測定待測物含量是依據酶促反應產生熱量多少來進行。經過溫度改變推測待測物含量。第87頁88酶熱敏電阻基本組成密接型柱式反應器型第88頁89酶熱敏電阻測溫方式第89頁酶熱敏電阻測量系統(tǒng) 第90頁91酶載體特點： 機械強度高，耐壓性好； 固定化效率高； 化學及生物學穩(wěn)定性高。當前，載體除多孔玻璃以外，還有

19、多糖類凝膠或尼龍制毛細管等。第91頁92優(yōu)點： 容量小、響應快、穩(wěn)定性好、使用方便、價格廉價。 第92頁934.4 光纖光學型酶傳感器高錕生于1933年，取得諾貝爾物理學獎“光纖之父”第93頁94光纖傳感器組成：光纖生物敏感膜（探頭）光電換能器第94頁(c)單束光纖，生物敏感膜與光纖為一體生物敏感膜(a)雙束光纖 (b) 單束光纖， 生物敏感膜在端部光纖生物傳感器信號轉換器三種結構第95頁光纖光學生物傳感系統(tǒng) 第96頁1.光纖生物傳感器特點 抗干擾能力強，不受電磁場干擾； 不用參比電極，能夠微型化； 實現遠距離遙測； 響應速度快，靈敏度高。第97頁2. 光纖酶傳感器工作原理 待測物質從樣品溶液

20、中擴散到生物敏感膜時，在固定化酶催化下生成一個待檢測物質； 當底物擴散速度與催化產物生成速度達成平衡時，即可得到一個穩(wěn)定光信號，依據光信號大小與底物濃度函數關系，得到底物濃度，普通情況下光信號大小與底物濃度成正比。第98頁3. 光纖酶傳感器分類 按照換能器能量轉換方式不一樣，分為化學發(fā)光型、光吸收型、熒光猝滅型、指示劑型和生物發(fā)光型。第99頁（1）化學發(fā)光型 一些化學反應伴隨光子釋放，釋放光子即化學發(fā)光強度與待測物濃度呈線性關系。 但有些生化反應不能釋放光學信號，需要引入中間物，使其轉變成能進行光檢測信號。 第100頁 魯米諾（luminol）（3-氨基-鄰苯甲酰肼），又稱發(fā)光氨、光敏靈。在堿性條件下能被許多氧化劑（比如H2O2，ClO-等）氧化而發(fā)出藍色光，是研究最早、最多、應用最廣泛發(fā)光試劑。第101頁谷氨酰胺 谷氨酸+NH3谷氨酸+O2+H2O 酮戊二酸+H2O2+ NH3魯米諾+ H2O2 氨基鄰苯二甲酸+N2+h谷氨酰胺酶谷氨酸氧化酶第102頁魯米諾+ H2O2 氨基鄰苯二甲酸+N2+h第103頁 GOD氧化葡萄糖，生成過氧化氫開啟魯米諾電化學發(fā)光，并經過光纖傳感器檢測發(fā)光信號。酶促反應和發(fā)光反應同時發(fā)生，所以傳感器響應非?？臁ｔ斆字Z+ H2O2 氨基鄰苯二甲酸+N2+h第104頁（2）光吸收型 假如被測物A不含有光學