發(fā)酵飼料生產工藝與應用

1、發(fā)酵飼料生產工藝與應用靈璧縣立騰同創(chuàng)農牧科技有限責任公司二0一二年十一月目 錄安徽省立騰同創(chuàng)農牧科技有限公司 簡介安徽省立騰同創(chuàng)農牧科技有限公司 企業(yè)文化安徽省立騰同創(chuàng)農牧科技有限公司的十年發(fā)展戰(zhàn)略 安徽省立騰同創(chuàng)農牧科技有限公司的第一個發(fā)展五年發(fā)展計劃發(fā)酵飼料生產的菌種及發(fā)酵工藝發(fā)酵飼料生產技術第一章 發(fā)酵飼料生產的菌種及發(fā)酵工藝概述發(fā)酵飼料的定義發(fā)酵飼料的定義是：在人為可控制的條件下，以植物性農副產品為主要原料，通過微生物的代謝作用，降解部分多糖、蛋白質和脂肪等大分子物質，生成有機酸、可溶性多肽等小分子物質，形成營養(yǎng)豐富、適口性好、活菌含量高的生物飼料或飼料原料。采用發(fā)酵技術生產的動物飼料

2、或飼料原料，其特性主要是：（1）含有大量的活性微生物；（2）多數以厭氧發(fā)酵方式進行生產；（3）未經干燥的物料含水量通常在30%以上；（4）物料的酸性物質明顯增加，營養(yǎng)組成更合理；（5）生產原料以植物性農副產品為主。也有發(fā)酵成品是經過干燥處理的，比較典型的有發(fā)酵豆粕和發(fā)酵棉粕。在發(fā)酵過程中有大量的活性乳酸菌和酵母菌發(fā)生的代謝作用，經過干燥以后，乳酸菌基本都失活了，但是它們也屬于發(fā)酵飼料。發(fā)酵飼料的概述發(fā)酵飼料的生產工藝基本都是以固態(tài)發(fā)酵的方式進行的，生產菌種以乳酸菌、芽孢桿菌和酵母菌為主，絕大多數采用厭氧或兼性厭氧發(fā)酵。發(fā)酵物料的含水量為30%50%，發(fā)酵時間和溫度受環(huán)境影響很大，基本不進行人為

3、控制和調節(jié)。在實際生產中也有采用好氧發(fā)酵方式進行的，生產菌種以霉菌和假絲酵母為主，生產用的蛋白原料主要是一些乳酸菌和酵母菌難以降解的雜粕和膠質蛋白。但是生產設備復雜，物料溫度和濕度變化很大，控制及其困難。成品主要是作為飼料蛋白原料的替代物，能降低飼料生產成本，但基本不具備生物學活性和功能。本節(jié)主要論述厭氧固態(tài)發(fā)酵工藝，常規(guī)的發(fā)酵飼料生產流程如：原料消毒冷卻接種培養(yǎng)干燥包裝工業(yè)化規(guī)模的微生物發(fā)酵過程基本上都是純培養(yǎng)過程，原料需要消毒，空氣需要過濾等。這些操作都是為了確保在發(fā)酵產品生產和儲存過程中不受雜菌的侵襲和干擾，但也正是這些常規(guī)操作使產品的生產成本居高不下，影響了微生物發(fā)酵產品在動物飼養(yǎng)中的

4、大劑量使用。大量試驗證明，在不考慮動物飼養(yǎng)成本的前提下，大劑量（在配合飼料中添加5.0%以上）使用高活菌含量的微生物發(fā)酵飼料可以明顯改善動物的生產性能，提高動物的健康水平，甚至可以進行無抗生素飼養(yǎng)。但是采用傳統(tǒng)的生產工藝獲得的高活菌產品其生產成本通常都在10元/kg以上，如果以10%的比例使用在配合飼料中，每噸配合飼料的成本至少需要增加800元，這個增加值對傳統(tǒng)的畜禽養(yǎng)殖業(yè)來說是難以接受的。降低發(fā)酵飼料生產成本最直接的方式就是簡化生產工藝，其中原料的蒸煮、消毒和干燥是最耗能的操作過程，是導致生產成本增加的主要步驟，也是導致生產設備投資增加的主要原因。如能簡化生產操作工藝步驟，同時又能保證產品質

5、量的安全穩(wěn)定，就能使發(fā)酵飼料的生產和應用具備強大的市場競爭力。發(fā)酵飼料的生產菌種發(fā)酵飼料的生產菌種很多，主要有：乳酸菌、芽孢桿菌、酵母菌和霉菌。乳 酸 菌目前生產中使用的乳酸菌至少有30多種。按乳酸菌的代謝途徑，大致可歸納為四種類型：同型乳酸發(fā)酵、專性異型乳酸發(fā)酵、兼性乳酸發(fā)酵和雙歧桿菌異型乳酸發(fā)酵。同型乳酸發(fā)酵C6H12O6 2CH3CH(OH)COOH一分子葡萄糖分解成兩分子乳酸，整個過程不產氣，發(fā)酵轉化理想，產物最合適，效率最高。典型的生產菌種主要有：德氏乳酸桿菌、嗜酸乳桿菌、唾液乳桿菌、嗜熱乳桿菌、糞腸球菌、乳酸乳球菌。專性異型乳酸發(fā)酵C6H12O6 CH3CH(OH)COOH+CH3

6、COOH+CO2一分子葡萄糖轉化成一分子乳酸和一分子乙酸，另外還釋放一分子二氧化碳。相比同型乳酸發(fā)酵，這種發(fā)酵的轉化效率要低得多，而且還有產氣損失。典型的生產菌種主要有:發(fā)酵乳桿菌、高加索酸奶桿菌、短乳桿菌、巴氏乳桿菌。兼性乳酸發(fā)酵兼性乳酸發(fā)酵能同時進行同型乳酸發(fā)酵和異型乳酸發(fā)酵，這兩種代謝進行的程度和比例取決于菌種的性質和外界培養(yǎng)條件。典型的生產菌種有：植物乳桿菌、干酪乳桿菌、鼠李糖桿菌、清酒乳桿菌。雙歧桿菌異型乳酸發(fā)酵2C6H12O62CH3CH(OH)COOH+3CH3COOH比較典型的生產用菌種是動物雙歧桿菌。雙歧桿菌的培養(yǎng)要求很嚴格，對厭氧要求極高，目前還很難在實際生產中應用。乳酸菌

7、分布廣、種類多，有桿狀和球形兩大類。有單個、成對和鏈狀排列的，基本上都是厭氧菌或微需氧菌。在飼料青儲、發(fā)酵開始時就繁殖，到飼料因密封缺氧后仍然能繁殖，只是增殖的速度慢一些，而乳酸的生成速度卻快一些。乳酸菌能分解飼料原料中的糖，形成乳酸。乳酸能提高飼料的營養(yǎng)價值和適口性，同時還能抑制大腸桿菌和沙門氏菌等有害微生物的生長代謝，使飼料產品能長期保存。在飼料青儲和發(fā)酵的過程中，同型和異型乳酸發(fā)酵同時存在，產物除乳酸外還有少量乙醇和CO2。芽 孢 菌目前在生產中應用的芽孢菌有近十種，以桿菌為主，主要為以下三種：地衣芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌和蠟樣芽孢桿菌。芽孢桿菌能耐受高溫，在有氧和無氧條件下都能存活。在營

8、養(yǎng)缺乏、干旱等條件下形成芽孢，在條件適應時又可以重新萌發(fā)成營養(yǎng)體。利用芽孢桿菌發(fā)酵飼料的目的主要是為了消耗培養(yǎng)體系中殘留的氧氣，為乳酸菌創(chuàng)造一個厭氧環(huán)境。另外，近年來研究還發(fā)現(xiàn)，有些芽孢桿菌能產生殺滅大腸桿菌和沙門氏菌等有害微生物的細菌素（也稱抗菌肽），這些抗菌肽有很強的針對性，只對某些類型的微生物細胞有破壞作用，對酵母菌和乳酸菌沒有影響。酵 母 菌酵母菌是一類單細胞真菌，形態(tài)多種多樣，主要有球形、卵形和絲狀形（如假絲酵母），以出芽的無性繁殖為主，最適宜生長溫度為2535，pH偏酸性（4.06.0）。酵母菌基本上都是兼性厭氧菌，在有氧的條件下迅速增殖，在無氧的情況下進行酒精發(fā)酵（EMP）。目前

9、在生產中應用的有20多種，主要為以下三種：釀酒酵母、熱帶假絲酵母、產朊假絲酵母。啤酒酵母和面包酵母是最常用的釀酒酵母。熱帶假絲酵母和產朊假絲酵母的生長速度很快，在適宜的溫度和營養(yǎng)條件下，它們的世代倍增時間不超過3h，特別適合處理食品加工業(yè)產生的廢水。酵母菌的個體比乳酸菌大得多，直徑通常為26m，體積幾乎是乳酸菌的1000倍左右。工業(yè)生產中常用的酵母菌主要有釀酒酵母和假絲酵母，釀酒酵母是生產啤酒、白酒等含乙醇類發(fā)酵物的重要菌種；假絲酵母主要用于好氧發(fā)酵生產動物飼料或者廢水處理。霉 菌目前在生產中應用的霉菌有近十種，主要為：米曲霉、黑曲霉、白地霉。一般來說利用霉菌發(fā)酵，基本上都是有氧發(fā)酵，發(fā)酵過程

10、會產生大量的代謝熱，生產過程中料曲的溫度控制往往是生產成敗的關鍵。霉菌發(fā)酵目前采用淺盤發(fā)酵，料曲厚度不超過5cm。如果采用厚層發(fā)酵，需采用強通風裝置，生產能耗很大，從這一點上說，霉菌發(fā)酵不適于生產飼料或者飼料原料。目前，實際生產中利用霉菌主要是利用它能合成纖維素酶、半纖維素酶和蛋白酶的特性，利用廉價的粗蛋白原料作為發(fā)酵底物，生產高活性的蛋白飼料或者粗酶制劑。選用生產菌種的基本原則安全性（必須同時符合以下兩個要求）菌體本身不產生有毒有害物質。不會危害環(huán)境固有的生態(tài)平衡（主要針對某些基因工程菌）。（二）有效性（能滿足一個要求即可）菌種本身具有很好的生長代謝活力，能有效降解大分子好抗營養(yǎng)因子，合成小

11、肽和有機酸等小分子物質。能保護和加強動物微生物區(qū)系的正平衡。這種功效主要是指能有效維護和提高有益微生物在動物消化道中的數量優(yōu)勢，其可通過兩種方式達到：一種方式是利用發(fā)酵飼料的生產菌種本身就是從飼養(yǎng)的目標動物的消化道中分離出來的有益菌，通過飼喂高比例的發(fā)酵飼料直接提高有益微生物的數量，形成數量優(yōu)勢；另一種方式是利用生產菌種或代謝產物可以選擇性地抑制或者殺滅有害微生物，形成有益菌的數量優(yōu)勢。實現(xiàn)第二種途徑的方式可以多種多樣，比較常用的有：耗盡氧氣，降低體系的氧化還原電位；降低環(huán)境的pH值；代謝物中含有能選擇性殺滅大腸桿菌和沙門氏菌等有害微生物的抗菌物質等。發(fā)酵飼料生產菌種之間的相互關系目前人類可利

12、用的這些發(fā)酵技術基本上都是純培養(yǎng)技術，而實際上在自然界中很難找出單一微生物存在的生態(tài)環(huán)境。據已有的微生物研究報道，地球上存在的微生物超過100萬種，而人類所分離的純種累計不超過10萬種，做過比較系統(tǒng)研究的不超過1萬種。根據目前已有的研究成果，大體可以把微生物之間的關系分為以下幾種：中性共生、同住、互惠共生、共生、競爭、拮抗和寄生。中 性 共 生這是指兩種或兩種以上的微生物同時存在于同一個環(huán)境中，但是它們之間沒有直接的生態(tài)關系，各自生活互不干擾。例如淡水中生長的衣藻和水生細菌。同 住這是指兩種微生物同處在一個棲所內，其中一個獲益，另一個不受影響。常見的現(xiàn)象是一種微生物產生一種代謝物供另一種微生物

13、作為營養(yǎng)物質，或者產生適合于另外一種微生物生長的環(huán)境。發(fā)酵飼料生產中比較常見的例子有以下幾種：酵母菌能在高濃度的糖液（25%左右）中生長。當糖被酵母菌消耗以后，糖濃度的降低就有利于不耐受高滲透壓的微生物（如乳酸菌）的生長。能分泌淀粉酶的微生物（芽孢菌）水解淀粉產生寡糖和單糖，為另外一些只能利用還原性單糖的微生物生長提供營養(yǎng)。還有一種比較特殊的同住微生物，好氣性菌可消耗氧氣，降低環(huán)境的氧化還原電位，使之適合于厭氧微生物的生長。這種同住關系只能產生在開始階段，在后期就不是同住關系了。這種現(xiàn)象在發(fā)酵飼料到生產過程中經常遇到，也是利用微生物組合發(fā)酵生產發(fā)酵飼料的重要理論基礎。互 惠 共 生這是兩種微生

14、物互惠互利的現(xiàn)象，比較典型的菌種是阿拉伯糖乳桿菌和糞鏈球菌的組合。阿拉伯糖乳桿菌不能合成苯丙氨酸，糞鏈球菌不能合成葉酸。阿拉伯糖乳桿菌不能在缺少苯丙氨酸的培養(yǎng)基上生長，糞鏈球菌也不能在沒有葉酸的培養(yǎng)基上生長。但是把它們組合在一起，卻可以共同在沒有苯丙氨酸也沒有葉酸的培養(yǎng)基上生長，因為它們能相互為對方提供必需的限制性營養(yǎng)物質。這種現(xiàn)象在自然界中普遍存在，發(fā)酵飼料的菌種組合應該多考慮這種組合優(yōu)勢。共 生共生是指兩種微生物在同一個嚴酷環(huán)境中彼此相依為命。比較典型的例子是地衣，它是藍細菌（或藍藻）與真菌共同組成的一個形態(tài)和生理單位。藍藻或藍細菌的細胞僅限于特定的層內，地衣內的菌絲交織成菌絲組織，形成一

15、個稠密的外皮層。皮層下為藍藻的細胞層，在下面為菌絲疏松交織的菌髓層。真菌可以從藍藻獲得碳水化合物，真菌菌絲所攝取的水和無機鹽又可以提供給藍藻，因此地衣能耐干旱、潮濕和抗寒冷。這種現(xiàn)象在發(fā)酵飼料的生產過程中很難遇到，少有實用的例子。競 爭當兩種微生物對某種環(huán)境因子有相同要求時，就會發(fā)生生存競爭。由于微生物的世代時間比較短，代謝強度大，所以生存競爭往往表現(xiàn)的很激烈。在一個生存環(huán)境內，不同的時間會出現(xiàn)不同的優(yōu)勢種。這種優(yōu)勢微生物在某種環(huán)境下能最有效地適應當時的環(huán)境，而環(huán)境條件一旦改變，就可能被另一種微生物代替并發(fā)育成新的優(yōu)勢種。目前工業(yè)化發(fā)酵生產之所以采用純種培養(yǎng)，其主要原因就是消除其他微生物的競爭

16、。目標代謝物合成能力強的微生物其生長速度往往比較低，至少比同類的野生菌低。野生菌的代謝活動是很“經濟的”。如果從生長速度分析，它們的物質和能量的利用效率要遠高于生產菌種。但是，由于生產成本的限制，發(fā)酵飼料的生產往往不能采用純種培養(yǎng)，所以微生物之間的生存競爭不可避免。如何巧妙利用微生物之間的生存競爭是研究微生物發(fā)酵飼料生產的一個非常重要的課題。從理論上分析，通過控制調節(jié)微生物生存環(huán)境可以調整物料中微生物的種類和數量分布，從而達到利用微生物有益菌群種群優(yōu)勢發(fā)酵飼料的目的，但是到目前為止，有關方面的成熟技術還是很少。六、拮 抗一種微生物可以產生不利于另一種微生物生存的代謝物質，或者通過代謝活動改變生

17、存環(huán)境，而這種環(huán)境不利于其他周圍微生物的生長，這種現(xiàn)象就稱為“拮抗”。如：青貯飼料接種的乳酸菌和醋酸菌在發(fā)酵過程中，不斷降低pH值，結果絕大多數不耐酸的微生物不能生存，甚至趨向死亡。酵母菌在無氧條件下將糖發(fā)酵成酒精，當酒精濃度達到一定數值時，其他微生物就不能生存。研究發(fā)現(xiàn)拮抗還具有明顯選擇性，農業(yè)部飼料工業(yè)中心分離獲得的枯草芽孢桿菌MA139能分泌殺滅大腸桿菌、沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抗菌肽（細菌素），但對自身、酵母菌和乳酸菌的生長代謝基本沒有影響，這種拮抗的選擇性是發(fā)酵飼料研究所希望的。七、寄 生一種微生物生活在另一種微生物體內或體外，依靠攝取寄生細胞的營養(yǎng)進行生長繁殖，并使后者遭受損害甚

18、至死亡，這種現(xiàn)象稱之為寄生。這種現(xiàn)象在飼料發(fā)酵過程中可能存在，目前在研究中還沒有遇到。微生物是發(fā)酵飼料的動力來源，研究發(fā)酵飼料中微生物的相互關系是獲得高質量發(fā)酵飼料的必要前提，也是飼料發(fā)酵生產的核心。第四節(jié) 發(fā)酵飼料的生產工藝固態(tài)厭氧發(fā)酵高活性生物飼料相對于好氧發(fā)酵，厭氧發(fā)酵的能耗低，微生物代謝產生的熱量也要小得多，生產過程往往不需要翻拌散熱。另外，發(fā)酵產品只要密封得當，即使長期存放也不會腐敗變質。目前比較典型的固態(tài)厭氧發(fā)酵生物飼料的成功例子主要有兩種：一種是適合養(yǎng)殖戶自產自用的袋裝發(fā)酵飼料；另一種是屬于規(guī)?；魉€生產的袋裝發(fā)酵飼料。它們接種的微生物基本一致，主要有酵母菌、乳酸菌和芽孢桿菌。

19、適合養(yǎng)殖戶自產自用的發(fā)酵袋是一種普通的密封包裝袋，物料接種以后裝袋，再將袋口用繩扎緊，物料的含水量為30%40%。開始時，酵母菌消耗袋內殘留的氧氣進行增殖和呼吸代謝，同時也為乳酸菌創(chuàng)造一個厭氧的生活環(huán)境。然后，酵母菌在無氧條件下進行糖酵解，產生酒精和CO2，乳酸菌也同時增殖、代謝，產生有機酸。隨著袋內氣壓的不斷增加，不斷有CO2帶著酒精和有機酸排出袋外，管理飼料的飼養(yǎng)員可以根據排出的酸香味來判定物料發(fā)酵的成熟度。有氧發(fā)酵階段：C6H12O6+6O26CO2+6H2O無氧發(fā)酵階段：C6H12O6 2CO2+2C2H5OH(乙醇)在夏季，發(fā)酵35d就有明顯的酸香味。在冬季，時間需要延長。如果環(huán)境溫

20、度低于12，發(fā)酵就有可能歸于失敗。酵母在低溫下長期代謝低迷，不產生CO2，使得外界的O2長時間與接種的乳酸菌接觸，會導致乳酸菌活力大減，甚至死亡。事實證明，如果環(huán)境溫度適宜，時間控制得當，采用上述袋裝式土辦法發(fā)酵，也可以獲得質量很好的微生物發(fā)酵飼料，活性乳酸菌的含量能達到108cuf/g以上。將其在生羊配合飼料中添加15%20%，生羊采食量能明顯提高，最多能提高10%以上，而且增重速度和健康水平也有顯著提高。這種工藝雖然簡單，但是受限制的因素很多，質量標準也很難把握，實際推廣有一定困難。為了使這種袋裝發(fā)酵技術進入程序化、工業(yè)化應用，發(fā)酵飼料的質量能得到有效保證，必須完成以下幾個前提：發(fā)酵過程不

21、受環(huán)境溫度限制；產品質量不受存放時間限制，或者保質期能達到三個月以上；產品在儲存和運輸過程中不受外界空氣干擾。農業(yè)部飼料工業(yè)中心的微生物發(fā)酵飼料課題組發(fā)明了呼吸膜可移動式固態(tài)厭氧發(fā)酵飼料（也稱袋裝發(fā)酵飼料）生產技術。這種發(fā)酵技術的具體工藝流程如圖1-1。發(fā)酵原料發(fā)酵原料粉碎機過 渡 倉電 子 秤攪拌機菌種液計量和包裝機成品原料接種以后直接進入包裝袋中，包裝袋上附加一個可以調節(jié)氣壓的硅膠膜。在發(fā)酵過程中，微生物會產生CO2等氣體，使得袋內的氣壓大于外界常壓。當袋內氣壓達到某一臨界值時，氣體通過硅膠膜排到外界。但是外界的氣體始終沒有機會進入發(fā)酵體系，從而也就排除了外界雜菌的干擾。 研制的特定微生物

22、菌種組合能使乳酸菌迅速繁殖，占據數量優(yōu)勢，原料不需要消毒就可以直接用于接種培養(yǎng)。這種工藝很簡單，如果以日產30t計算，設備投資不超過40萬元，特別適合在我國廣大農村推廣使用。發(fā)酵飼料生產技術發(fā)酵飼料用乳酸菌的分離篩選乳酸菌是一類最常見的益生菌，生物飼料的發(fā)酵生產一般都離不開乳酸菌。乳酸菌種類很多，市場上流行的產品也極多，至少有20多種。大量實驗證明，只有動物消化道國有的微生物才能在消化道內定植，外源微生物只能短時間存活在消化道內，不可能長期融合到動物消化道的微生態(tài)系統(tǒng)中。篩選發(fā)酵飼料的生產菌種，其主體應該來源于最終適用的動物消化道，而乳酸菌細菌是動物消化道內起主要作用的微生物。樣品的采集為了獲

23、得合適的生產用乳酸菌，樣品的采集很重要。適合于實際生產的乳酸菌必須來源于健康動物的消化道，最好是在發(fā)生了瘟疫的養(yǎng)殖場而幸存的畜禽。發(fā)生瘟疫的養(yǎng)殖場，動物大比例死亡，幸存的畜禽雖少，但是生命力很頑強，是極好的生產菌種采集樣本。以下以篩選符合生羊健康養(yǎng)殖需要的生物飼料用乳酸菌為例，敘述樣品的采集和乳酸菌的分離。在實驗室中對生羊進行攻毒試驗，在飼料中不斷加大大腸桿菌（實驗用E.ColiK88,這是一種常見的攻毒試驗用大腸桿菌）的用量，以檢驗生羊的抵抗力。經過57d的試驗，生羊的健康水平越來越差。我們選擇其中兩頭最健康的生羊進行屠宰，在無菌環(huán)境中提取它的胃液、小腸液和大腸液，迅速保存在無菌生理鹽水（N

24、aCl的濃度為0.9%）中。目標乳酸菌一般都是厭氧菌，為了確保乳酸菌的活力，需要盡可能降低生理鹽水的氧化還原電位。最簡便的方法是在溶液中加入適量的半胱氨酸，半胱氨酸有巰基（SH），有很好的還原力，可以消除溶液中殘余的氧。乳酸菌的分離純化樣品中的目標乳酸菌含量一般都不是很高，而且還污染了其他雜菌。為了提高篩選成功的幾率，在樣品進行分離純化以前，可以對樣品進行選擇性增殖培養(yǎng)，以增加目標乳酸菌的含量。樣品的增殖培養(yǎng)比較簡單，把經過適當處理的樣品接種到適于目標乳酸菌生長的培養(yǎng)基中。比較常用的是牛奶增殖培養(yǎng)液，在無抗生素牛奶中補充6%8%的蔗糖，高溫消毒、冷卻，然后用氮氣或者二氧化碳驅除溶液中殘留的空氣

25、，再接入適量采集的樣品，在3032條件下厭氧培養(yǎng)1024h。如果樣品中的目標乳酸菌含量比較低，可以適當延長培養(yǎng)時間。樣品經過預增殖培養(yǎng)以后，目標乳酸菌含量明顯提高，可以進入下一步分離純化操作。乳酸菌分離培養(yǎng)基通常采用MRS瓊脂培養(yǎng)基，其營養(yǎng)組成與pH如下：蛋白胨：5.0g/L；牛肉浸膏：4.0g/L；酵母膏：2.0g/L；葡萄糖：12.0g/L；玉米漿：10.0mL;司盤80：1ml;磷酸氫二鉀：1.0g/L；三水乙酸鈉：3.0g/L；檸檬酸三銨：1.0g/L；硫酸鎂：0.1g/L；硫酸錳：0.03g/L；瓊脂：18.0g/L。pH6.20.2。加熱溶解上述各組分，配制成均勻的溶液，分裝在厭氧

26、滾管中（每個管中加56mL）。在115消毒殺菌30min。冷卻至50左右后，在冰水中滾動滾管，使固體培養(yǎng)基均勻凝固在管壁上。為了指示培養(yǎng)基的氧化還原電位，可以在培養(yǎng)基中加入極少量的刃天青（一種顯色劑），濃度0.02%就足夠了。在低電位時培養(yǎng)基顯藍色，隨氧化還原電位不斷上升，培養(yǎng)基的顏色逐步由藍轉為淺藍、粉紅、紅色。如果培養(yǎng)基的顏色轉成粉紅就基本不合格了。同增殖培養(yǎng)過程一樣，在MRS分離培養(yǎng)基中加入適量的半胱氨酸可以在一定時間內維持環(huán)境的低電位。分離純化培養(yǎng)基準備好以后，就可以進行目標乳酸菌的分離操作了。在超凈工作臺上（或者其他無菌環(huán)境中），對經過增殖培養(yǎng)的樣品進行梯度稀釋，稀釋液還是用無菌的生

27、理鹽水，把稀釋后的樣品接種到厭氧滾管中，密封（滾管有密封蓋）。在3032條件下培養(yǎng)12d。為了提高篩選幾率，可以同時做多個稀釋梯度樣品的培養(yǎng)。如果兩天以后不出現(xiàn)理想的菌落，可以再延長培養(yǎng)時間。雖然乳酸菌的最適宜生長溫度是3740，但是在分離篩選過程中，培養(yǎng)溫度應適當調低，以降低其生長速度，這樣菌落之間的差異可以更明晰，也更有利于挑選理想的菌種。經過上述分離操作，我們獲得了5株乳酸菌，它們分別是：1.來源于羊胃的格氏乳桿菌（Lactobacillus gasseri）;2.來源于十二指腸的羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）;3.來源于小腸的屎腸球菌（Enterococcu

28、s faecium）;4.來源于空腸的嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）;5.來源于結腸的發(fā)酵乳桿菌（Lactobacillus fermentium）。三、發(fā)酵力和耐酸穩(wěn)定性分析為了后續(xù)生產應用的需要，我們對分離獲得的乳酸菌進行發(fā)酵力測定和耐酸穩(wěn)定性試驗。發(fā)酵力測定比較簡單，主要測定其乳酸菌的產量，具體方法如下：接種分離獲得的細菌純種于試管培養(yǎng)液中，3032恒溫培養(yǎng)12h，然后再擴大接種到牛奶瓶中，3032恒溫培養(yǎng)6h，測定乳酸含量。在乳酸發(fā)酵的過程中乳酸通常以乳酸鈣的形式存在， 通過去除發(fā)酵液中的葡萄糖和蛋白質，并加入適當濃度硫酸酸化，鈣離子轉化成難溶的硫酸鈣

29、沉淀，使溶解度不高的乳酸鈣全部轉變?yōu)槿樗帷Ｈ樗嵩阢~離子的催化下，與濃硫酸作用生成乙醛，乙醛能與對羥基聯(lián)苯作用生成在 565 nm 處有特征吸收的紫色物質。在一定濃度范圍內，乳酸含量與 565 nm 處波長吸光度呈線性關系，因此，可以通過測定 565 nm 處的吸光度來測定乳酸的含量。實驗室乳酸含量的測定一、原 理稀乳酸在濃硫酸作用下加熱，可以變成乙醛。乙醛與羥基聯(lián)苯作用可以生成紅色的復合物，在565nm條件下比色測定，可以確定乳酸含量。二、試 劑1. 4.0%硫酸銅溶液 將4g無水硫酸銅溶解在水溶液中，定容至100ml。2. 羥基聯(lián)苯（C6H5C6H4OH）溶液將1g羥基聯(lián)苯溶解于100ml濃

30、度為0.08mol/L的NaOH溶液中，儲存在褐色試劑瓶中。3.乳酸標準液將280mg純乳酸鋰溶于水中，配成250mL溶液，其乳酸濃度為1mg/mL，存放于4冰箱中。在做標準曲線時將溶液稀釋10倍，使乳酸含量為100g/mL。在分別取1，2，3，4，5，6mL稀釋液，稀釋配制成1，2，3，4，5，6g/mL乳酸標準液。4.濃硫酸溶液在比色管中分別加入1mL乳酸標準液和0.05mL硫酸銅溶液，然后加入6mL濃硫酸，放置5min，冷卻至20以下。三、標準曲線的制備和乳酸含量的測定在上述比色管中加入0.05mL羥基聯(lián)苯溶液，混合均勻，在室溫下放置68h，過夜。在565nm波長下進行比色測定，繪制標準

31、曲線。（1） 最大吸收波長的確定乳酸發(fā)酵液樣品顯色后，表明，最大吸收波長為 565 nm。圖2-1最大吸收波長的確定（2） 最佳顯色條件的選擇結果表明，氫氧化鈣和濃硫酸的加入量對顯色反應影響顯著，其余因素的作用不顯著，最佳顯色條件為A2B3C2D1E1F3，即氫氧化鈣 0.05g，20%硫酸銅 0.8 ml，濃硫酸 6 ml，對羥基聯(lián)苯 0.125 ml，靜置時間 15 min，加熱顯色時間 5 min。（3） 乳酸標準曲線的制備乳酸標準應用液濃度在 1080 g/ml范圍內與吸光度值基本呈線性關系，當濃度大于等于 60 g/ml時吸光度值大于 1，考慮到儀器誤差的因素，故制備標準曲線時濃度范

32、圍取在 15、20、25、30、35、40、45、50 g/ml，得到如圖的乳酸標準曲線，求得標準曲線回歸方程為A=0.0189C0.0808(A為吸光度值，C為乳酸濃度，n=8)，r=0.9989，在 1550g/ml范圍內呈良好線性關系。（圖2-2：乳酸標準應用液濃度與吸光度值之間的關系）（圖2-3：乳酸標準曲線）本實驗對發(fā)酵液進行預處理，排除蛋白質和葡萄糖的干擾，使測定結果更接近真實值；優(yōu)化了顯色條件，使測定時操作簡便，精確度高，顯色穩(wěn)定，準確度高，適合于發(fā)酵液中乳酸含量的測定。耐酸穩(wěn)定性分析主要是考慮乳酸菌在實際使用過程中過動物胃酸的成活問題。生長育肥羊的胃酸pH比較低，一般的微生物很

33、難在其中存活，這種功能實際上也利于生羊的健康，使它可以在衛(wèi)生條件比較差的環(huán)境中生存。但是這種特性不利于外源有益微生物的存活，外源有益菌必須先通過胃液的考驗才能達到其發(fā)揮作用的場所（腸道）。所以耐胃酸穩(wěn)定性也是決定乳酸菌實際使用效果的一個重要指標，具體檢驗方法如下：取1.0mL活菌數量已知的培養(yǎng)液，在無菌條件下，接種到生長羊、牛的胃液中，在37恒溫培養(yǎng)。同時做6個平行，每隔1h取樣1次，分析乳酸菌數量的變化。在生長羊胃液中，上述5株菌都體現(xiàn)了很好的穩(wěn)定性，其存活率都在50%以上（見表2-4）表3-4 各種乳酸細菌在生長羊胃液中的穩(wěn)定性時間/h123456格氏乳桿菌存活率/%88.282.691.

34、495.8112136羅伊氏乳桿菌存活率/%88.481.371.466.957.246.8屎腸球菌存活率/%86.562.176.371.264.855.6嗜酸乳桿菌存活率/%91.288.684.276.871.364.2發(fā)酵乳桿菌存活率/%94.692.891.488.586.384.6本組試驗均是在羊消化道中分離獲得的乳酸菌都是天然菌，沒有經過基因工程改造，屬于安全菌株。遺傳性能穩(wěn)定，不會隨著傳代而發(fā)生變異，安全無毒?？梢源罅繎迷谂?、羊等飼料中。另有研究提出在模擬的胃酸中（pH值與真實胃液胃酸相同）進行穩(wěn)定性試驗，其結果不能代表乳酸菌在真正胃液胃酸中的穩(wěn)定性，其原因是真實胃液中蛋白酶

35、對外來生物活性物質具有極強的分解作用，破壞了相當部分外來多酶蛋白和一些細菌素的活性。這是自然界一種自我保護的功能。第二節(jié) 發(fā)酵飼料用芽孢桿菌的分離篩選和安全性評價芽孢桿菌也是一類比較常見的發(fā)酵飼料生產菌，但是這類菌的應用效果與菌種來源、飼養(yǎng)環(huán)境和動物類型都有很大的關系。雖然種類很多，但是真正能體現(xiàn)出穩(wěn)定的、優(yōu)良效果的還很少。另外，芽孢桿菌不同于乳酸菌和釀酒酵母（或者啤酒酵母），乳酸菌和酵母菌的安全穩(wěn)定性一般都很可靠（一些耗氧發(fā)酵的絲狀酵母除外），但是芽孢桿菌的安全穩(wěn)定性卻一直是行業(yè)主管部門關注的重點。芽孢桿菌一般都不是動物消化道內固有菌，它們發(fā)揮作用的原因至今還沒有統(tǒng)一的定論。但是目前人們對兩

36、點原因是比較認可的：產生能殺滅大腸桿菌和沙門氏菌等有害微生物的抗菌肽類物質（或者稱為細菌素）；消耗環(huán)境中的氧氣，為乳酸菌的生長繁殖創(chuàng)造厭氧環(huán)境。芽孢桿菌的分離篩選主要也是依據上述兩個原則。安全性評價主要依據抗生素敏感性以及致毒性，相關的技術都比較成熟。一、樣品的采集和初篩與乳酸菌的分離篩選一樣，目標芽孢桿菌也是從發(fā)生了瘟疫的動物養(yǎng)殖場或者進行攻毒試驗幸存的動物體中篩選。1.樣品的采集與初篩在發(fā)生了大批死亡的養(yǎng)殖場里，我們從土壤和糞便中采集樣品，共需采集24個樣品，每個樣品約2g，在無菌條件下分別保存在20mL無菌生理鹽水中，并用冰塊降溫，在12h內進行后續(xù)的培養(yǎng)分離，具體方法如下：（1）取0.

37、5ml樣品液，加入到5ml的復合營養(yǎng)肉湯（MNB）中。MNB培養(yǎng)基組成與pH：葡萄糖：5.0g/L;蛋白胨：5.0g/L；牛肉膏：3.0g/L;酵母浸粉：1.0g/L;MgSO4H2O:0.005g/L。pH:7.00.2把上述組分均勻溶解在水溶液中，在120消毒30min，然后冷卻到常溫，備用。（2）從24種樣品中分離得到芽孢桿菌菌株約120株，這些芽孢桿菌均具有革蘭氏陽性、過氧化物酶陽性、產生好氧芽孢的特性，但是僅有6株對E.coliK88具有強烈的抑制作用，它們都基本具備了芽孢桿菌的特性，將此6株菌株編號為：MA23、MA139、MA257、MA59、MA633和MA744，并將這6株作

38、為后續(xù)復篩的備選菌種。二、菌種的復篩在芽孢桿菌的復篩過程中，設計了待篩菌與4種指示菌同步混合培養(yǎng)的方法，這種設計的目的：創(chuàng)造豐富的營養(yǎng)條件便于候選菌株的富集生長；采用指示菌混合培養(yǎng)，給候選的芽孢桿菌營造一個競爭的環(huán)境，有利于產生高抗菌活性的芽孢桿菌，并能在有限的環(huán)境中為爭奪營養(yǎng)條件，拮抗其他細菌而存活下來。同時在不同的試管中分別接種4種指示菌（見表3.5），濃度約為106cfu/mL。表2-5 4種指示菌及其來源指 示 菌學 名來 源金黃色葡萄球菌鼠傷寒沙門氏菌大腸桿菌 K88大腸桿菌 K99Staphylococcus IVDC C56005SalmonellatyphimuriumIVDC

39、 C79-13Esherichia coli IVDC C83901Esherichia coli IVDC C83529中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中心中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中心中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中心中國獸醫(yī)微生物菌種保藏中心在上述4個指示菌中，大腸桿菌K88的抵抗力最強，金黃色葡萄球菌抵抗力最弱。制備指示菌懸液時，用接種針從斜面上挑取少量的指示菌，分別接種到營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基（MNB）中，37培養(yǎng)1824h，保證菌懸液的濃度為108cfu/mL左右。接種菌液后，在37混合震蕩培養(yǎng)48h，培養(yǎng)液然后置于70的水浴中保溫30min，殺死營養(yǎng)細胞。存活的芽孢經過10倍稀釋，取一定的稀釋液涂布于MNA固

40、體培養(yǎng)基（在MNB培養(yǎng)液中加入1.8%左右的瓊脂）平皿表面，使之形成單菌落。根據菌落形態(tài)的差異，挑起產芽孢的、革蘭氏陽性的單菌落，接種到試管斜面中，編號后保存在4冰箱中。然后在采用平板擴散的方法，將分離出來的芽孢桿菌用滅菌牙簽蘸取少許分別點種到倒好的MNA平板中（平板在使用前置于37下培養(yǎng)24h，除去部分水份以便于抗菌物質在培養(yǎng)基中擴散），37培養(yǎng)24h，然后把平板倒扣于盛一薄層氯仿的培養(yǎng)皿蓋上并熏蒸約40min，以便殺死活細胞并能讓菌落固定于平板的表面，然后移去培養(yǎng)皿蓋并讓平板里殘余的氯仿?lián)]發(fā)30min（以揮發(fā)徹底）。在平板表面鋪一層剛培養(yǎng)好的指示菌培養(yǎng)液，均勻布滿后傾倒出剩余的菌液，晾干平

41、板，置平板于37培養(yǎng)1618h，觀察點種的芽孢桿菌周圍抗菌圈的大小和清晰程度，來判斷受試菌對指示菌的抗菌能力。這6種芽孢桿菌當中，MA139對4株指示菌表現(xiàn)出最強的抗菌能力（見表2-6、圖2-7）。表2-6 初分離出6株芽孢桿菌對4株指示菌的抑菌圈直徑菌株抑菌圈直徑/mmE. coliK88E.coliK99Staph.aureusS.typhimuriumMA2329.80.635.60.746.80.540.60.8MA13932.01.035.90.747.50.542.50.7MA35728.20.435.00.645.40.840.80.7MA55931.30.933.60.844.

42、41.138.30.9MA63429.60.731.51.245.60.638.61.0MA74431.01.033.60.645.70.838.41.1注：表中值為平均值標準差。圖2-7 MA139對指示菌的抑制作用（A、B、C、D分別代表對大腸桿菌K88、K99、鼠傷寒沙門氏菌和金黃色葡萄球菌的抑制作用）三、芽孢桿菌的抗逆性試驗與乳酸細菌的耐受性試驗一樣，芽孢桿菌也需要進行類似的檢驗。芽孢桿菌必須在胃腸道存活，同時還必須能夠經受住小腸液對菌體的破壞作用，也就是要求芽孢能夠抵抗小腸液中的膽鹽和胰液素對它的毒害作用。分別提取生長羊（體重4060kg）的胃食糜和小腸食糜，分別是用4層無菌醫(yī)用紗布

43、擠壓過濾，取濾液，檢驗芽孢桿菌的耐受性。生羊胃液中含有的食糜量對胃酸的pH有很大影響，食糜量越少，酸度越大。為體現(xiàn)良好的代表性，生羊胃液的樣本數可以適當多一些（通常取10份）混合以后在用紗布擠壓過濾。經過篩選出來細菌MA139，活化兩次后接種于MNB培養(yǎng)基中，37下225r/min震蕩培養(yǎng)36h，將培養(yǎng)液置于80水浴保溫15min，離心收集芽孢（相對離心力為2500g，5min），菌體用磷酸緩沖液（PBS:0.144%Na2HPO4,0.024%KH2PO4,pH7.0）洗滌兩次，最后復溶在PBS緩沖液中，即為菌懸液，用于后續(xù)的抗逆耐受性試驗。從試驗的結果發(fā)現(xiàn)，在胃液中保持3h，活性芽孢的數量

44、基本沒有下降，證明其對胃酸的耐受性很好。在小腸液中，起始24h內不生長，而24h后開始生長，培養(yǎng)液變得渾濁。在試驗的第5天，取樣染色分析，發(fā)現(xiàn)培養(yǎng)液中有大量芽孢增殖。表明MA139在小腸液中開始受到了一定的抑制，但是隨著培養(yǎng)時間的延長，能夠適應這種環(huán)境。表明MA139的芽孢可以在羊小腸中存活并通過營養(yǎng)體增殖。四、芽孢桿菌的鑒定通過上述的分離篩選，我們獲得了比較有價值的桿菌MA139，但是這株桿菌還沒有經過生理生化鑒定，我們只是從篩選的過程中體現(xiàn)的發(fā)酵特性方面初步認為是芽孢桿菌。在投入應用前，我們必須做嚴格的鑒定。形態(tài)學鑒定首先進行形態(tài)學鑒定，觀察其單菌落的形態(tài)，并對活細胞進行革蘭氏染色及芽孢染

45、色。MA139的細胞呈直桿狀，芽孢橢圓形近中生，孢囊不膨大。在MNA培養(yǎng)基上培養(yǎng)12h，產生黏液，細胞形態(tài)為長桿狀；24h后菌落圓形，隆起，表面皺褶，不透明，干燥；培養(yǎng)至36h，菌體均以休眠體芽孢的形式存在，菌落呈白色圖2-8（1）。在液體靜止培養(yǎng)時有菌膜形成。圖2-8生理生化鑒定形態(tài)鑒定結果（圖2-8）符合芽孢桿菌的特性，接著進行生理生化鑒定。生理生化鑒定比較復雜，涉及的操作步驟很多。參照常見細菌細菌系統(tǒng)鑒定手冊中的方法，對試驗菌種進行糖醇發(fā)酵試驗、需氧性測定、V-P試驗、淀粉水解試驗、明膠水解試驗、過氧化氫酶試驗、檸檬酸鹽利用試驗、石蕊牛奶試驗等。芽孢桿菌鑒定用培養(yǎng)基如下：糖醇發(fā)酵培養(yǎng)基及

46、葡萄糖產氣試驗 培養(yǎng)基組成：（NH4）2HPO4 1.0g/L;MgSo47H20 0.2g/L；酵母浸膏0.2g/L。配好后加入2%的溴百里香蘭指示劑1mL/L，調節(jié)pH為7.2，分別加入1%的底物（糖醇或者葡萄糖），按照底物類型分裝試管，并將杜蘭管口朝下放入試管，115滅菌30min。（2）運動型培養(yǎng)基 瓊脂：3g/L;牛肉膏：3.0g/L;氯化鈉：5.0/g；蛋白胨：10g/L。pH7.07.2。121滅菌15min。（3）V-P試驗培養(yǎng)基 蛋白胨：5.0g/L；K2HPO4:5.0g/L;葡萄糖：5.0g/L。pH7.00.2。2mL/支分裝試管，121滅菌15min。（4）耐鹽性試驗

47、培養(yǎng)基 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基分別加入2%、5%、7%、10%的NaCl,pH7.07.2。121滅菌15min。（5）石蕊牛奶試驗培養(yǎng)基 石蕊乙醇溶液25mL，脫脂牛奶1000mL，4mL/支分裝試管，115滅菌15min。（6）檸檬酸鹽試驗培養(yǎng)基 NaCl:5.0g/L；MgSO47H20:0.2g/L；（NH4）H2PO4：1.0g/L；K2HPO4：1.0g/L；檸檬酸鈉：5.0g/L溴百里草酚蘭（濃度為4%）。pH6.80.2。分裝試管，121滅菌15min。（7）明膠水解培養(yǎng)基 蛋白胨：0.5%；明膠：10%15%。pH7.07.2。分裝試管，115滅菌20min。（8）淀粉水解試驗培養(yǎng)基

48、 可溶性淀粉：20g/L；KNO3：1.0g/L；NaCl:0.5g/L；K2HPO4：0.5g/L；MgSO47H2O:0.1g/L；瓊脂：2.0g/L。pH7.07.2。121滅菌15min。（9）厭氧生長試驗培養(yǎng)基 營養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，分裝厭氧試管，充氮除氧，121滅菌15min。生理生化試驗結果見表2-9。表2-9 試驗菌的生理生化試驗結果項 目MA139 項 目MA139葡萄糖發(fā)酵+葡萄糖產氣-麥芽糖發(fā)酵+運動性+棉籽糖發(fā)酵+厭氧生長-乳糖發(fā)酵+淀粉水解試驗+甘露醇發(fā)酵+H2O2酶試驗+2%NaCl+檸檬酸鹽試驗+5%NaCl+石蕊牛奶還原+7%NaCl+V-P試驗+10%NaCl-明膠

49、液化試驗+“+”為反應陽性；“-”為反應陰性。根據生理生化的試驗結果，基本可以證明試驗菌MA139是芽孢桿菌?；蜩b定：16SrRNA分析為了進一步確證生理生化鑒定的可靠性，還可以補充進行基因序列分析。16SrRNA分析是目前比較常用的分析手段。采用基因組DNA提純試劑盒提取MAA139基因組DNA，并以此為模版，選擇細菌16SrRNA基因特性引物進行PCR擴增，并對擴增產物提純回收，測定16SrRNA序列。目前這種試驗在實驗設備比較完善的生物研究所實驗室都能進行。其結果證實MA139是枯草芽孢桿菌。五、芽孢桿菌的安全性評價確證了芽孢桿菌的特性，接下來需要考慮其安全性問題。益生菌菌種的安全性是

50、研究開發(fā)中必須關注的問題。這其中包括：生產菌種必須屬于官方公布允許使用的飼用微生物菌種；使用的菌種本身必須無毒無害，不會產生任何毒素；不存在耐藥性的質?；蛘吣退幮曰虿淮嬖谵D移的問題。以下還以枯草芽孢桿菌MA139為例，簡要說明進行芽孢桿菌安全性評價的方法。安全性試驗的靶動物一般都選用老鼠，具體可參考如下方法：選擇12只體重基本一致的SD大鼠（Sprague-Dawley,SD）,初始體重在200220g比較適合，雌雄各半，分為兩個實驗組，一組用5mL芽孢菌懸液（108cfu/mL）注射到大鼠腹腔中；另一組用5mL生理鹽水注射大鼠作為試驗對照。注射前禁食6h。灌服后觀察其中毒癥狀，看是否出現(xiàn)呼

51、吸困難、抽搐、肢體麻痹等。觀察時間為1周。灌服MA139的芽孢后，所有大鼠均無明顯臨床癥狀，無一死亡，試驗組和對照組間，沒有明顯差異，證明MA139安全無毒。六、抗生素敏感性試驗在實際生產中，絕大多數的動物飼料都添加了抗生素，動物的腸道經常處于抗生素壓力之下，這種選擇性壓力更容易促進細菌間耐藥性基因的傳遞和轉移。所以在選擇菌種的時候，對于哪些攜帶有可轉移耐藥性基因的質粒的細菌，從長遠考慮，在生產實際中一定不要采用。在抗生素尚未完全被益生素類的綠色添加劑完全取代的時候，抗生素有時會與益生素聯(lián)合添加，因而在菌株篩選的時候，會人為地篩選出對抗生素具有抗性的微生物應用于實際，這種短期行為也加大了耐藥性

52、細菌擴散和轉移的可能。所以，為了確保芽孢桿菌的使用效果，需要對抗生素的敏感性進行檢驗。研究結果顯示（表2-10，圖2-11），MA139對試驗的十種抗生素的敏感性不一樣，對桿菌肽鋅不敏感，對其它的抗生素都有一定的敏感性，對桿菌肽鋅的耐藥性可能與產生桿菌肽的細菌具有一定的同源性。 圖2-11 MA139對抗生素的敏感性表2-10 MA139對抗生素的敏感性抗生素名稱濃度抑菌圈直徑/mm結果判定大觀霉素Spectinomycin(SPT)100g/片26.5+桿菌肽Bacitracin(B)0.04IU/片0.0-卡那霉素Kanamycin(K)30g/片24.1+多黏菌素BPolymyxinB(

53、PB)300g/片12.8+呋喃唑酮Furazolidone(FR)300g/片21.3+紅霉素Erythromycin(E)15g/片24.0+氯霉素Chloramphenicol(C)30g/片28.7+四環(huán)素Tetracycline(TE)30g/片17.7+萬古霉素Vancomycin(VA)30g/片19.2+利福平Rifampin(RA)5g/片27.8+注：“+”為敏感；“-”為不敏感。從上述分析可以發(fā)現(xiàn)，芽孢桿菌的分離篩選遠比乳酸菌復雜，特別是在安全穩(wěn)定性方面的檢驗更是極為繁瑣。但是這些都是必須完成的工作，在實際生產過程中，任何步驟出現(xiàn)差錯都有可能導致很嚴重的后果。第三節(jié) 發(fā)酵

54、飼料生產菌種的制備和保存在獲得了飼料生產菌種以后，需要對生產菌種進行擴大培養(yǎng)和保存，在生產中稱為制種。生產企業(yè)的規(guī)模不同，準備生產菌種的方式也有差別。大型生產企業(yè)由于用量比較大，往往自己制種，現(xiàn)生產現(xiàn)用。生產規(guī)模比較小的企業(yè)傾向于購買菌種，或者部分購買，部分自己制備。 在前期的敘述中，我們已經知道，發(fā)酵飼料的生產菌種主要是乳酸菌、酵母菌和芽孢桿菌?，F(xiàn)在就針對這三種微生物的擴大培養(yǎng)和干燥保存進行論述。一、乳酸菌的培養(yǎng)乳酸菌是最常用的有益菌，一般都是厭氧菌，很難制成干粉，最好現(xiàn)培養(yǎng)現(xiàn)用。乳酸菌培養(yǎng)最簡便、最成熟的方式類似酸奶的發(fā)酵。在無抗生素污染的牛奶中加入6.0%8.0%的糖，經過消毒，冷卻至3

55、7左右，在無菌條件下接種、厭氧培養(yǎng)，就可以獲得比較理想的培養(yǎng)物。以下是在實際生產中采用的乳酸菌擴大培養(yǎng)方法。選取無抗生素污染的純牛奶10L，加入600800g白砂糖（也可用紅糖代替），加熱至6070，直至蔗糖完全溶解，然后分裝在500mL三角瓶中，用棉花塞塞緊，外包牛皮紙。在110左右消毒滅菌10min，冷卻至37左右，接種乳酸菌，這樣不僅可以提高糖酸轉化效率，而且乳酸菌培養(yǎng)過程容易控制氣壓。在3640恒溫培養(yǎng)2024h，就可以用于后續(xù)的發(fā)酵飼料擴大接種，乳酸菌培養(yǎng)液與發(fā)酵飼料的接種比例為0.2%左右。需要強調的是一定要用無抗生素污染的牛奶。乳酸菌一般對抗生素很敏感，溶液中只要有5mg/kg的

56、抗生素就會對乳酸的生長繁殖起到明顯的抑制作用，基本不能獲得合格的培養(yǎng)物。如果沒有合格的無抗生素污染牛奶，可以用無藥物污染的豆粕粉。豆粕經過浸泡、磨漿以后可以替代牛奶，豆粕干物質在溶液中的含量為8.0%左右，類似于豆?jié){，其后續(xù)的補糖和接種發(fā)酵過程與牛奶發(fā)酵過程類似。也可以用無抗生素污染的奶粉（如新西蘭奶粉）加水調漿（加水量是奶粉分量的8倍左右），恢復成原始牛奶的營養(yǎng)濃度。二、乳酸菌培養(yǎng)液的脫水干燥傳統(tǒng)的微生物培養(yǎng)液的干燥都是設法先除去培養(yǎng)液中的自由水。但是對乳酸菌培養(yǎng)液來說，除水是比較困難的單元操作。乳酸菌對熱和氧氣都很敏感，即使是高濃度的乳酸菌培養(yǎng)液，其含水量一般都超過90%，干物質的含量不超

57、過10%，除水通常需要較長的時間。對于厭氧的乳酸菌來說，與空氣接觸時間越長，活力損失也越大。采用常規(guī)的氣流干燥，乳酸菌的活性損失一般都要超過90%以上。即使采用瞬時噴霧干燥，活力損失也要超過85%。脫水后的制劑，在20條件下，在空氣中暴露24h，活力損失就會達到40%以上，給實際推廣造成很大困難。近年來，世界各地的畜牧科研工作者在活性乳酸菌的干燥保存方面進行了大量研究，提出了很多高科技的方法，其中比較常用的方法是抽真空冷凍干燥和包埋造粒。但因成本造價高昂，并不適合工業(yè)化生產。下面敘述是比較實用的乳酸菌脫水干燥方法：一般普通的大麥、小麥和玉米等農副產品的含水量都在14%左右，經過100氣流干燥以

58、后，可以比較簡單地把水份降低到6%左右。然后再用這些經過干燥的載體以大比例（10倍以上）與乳酸絕培養(yǎng)液混合，使混合物的水份含量為11%20%，從而使乳酸菌處于休眠狀態(tài)，不易失活。干燥冷卻后的載體可以迅速的吸附培養(yǎng)液中的游離水，然后在真空包裝。實驗表明，此方法保存的乳酸菌，在室溫條件下保存3個月，乳酸菌的活力可以保存50%以上，保存6個月時，乳酸菌的活力保存在40%左右。此方法簡便實用，成本低廉、質量穩(wěn)定，保質期長，且活性乳酸菌的回收率較高?；钚匀樗峋撍稍锪鞒坛檎婵彰芊獍b混合干燥載體抽真空密封包裝混合乳酸菌培養(yǎng)（二）流程說明1.載體的干燥載體為麥粉、玉米粉或者其他農副產品。粉碎后過20目篩

59、。對載體進行氣流干燥，檢測其含水量。將干燥后的麥粉收集在緩沖倉內，抽氣冷卻至40。如果緩沖倉的物料不超過1t，冷卻時間一般不超過2h，干燥后麥粉的含水量只增加0.3%左右，對后續(xù)的吸附操作影響很小。必要時可在冷卻后將干燥后的麥粉進行抽真空包裝，以防止吸濕回潮，包裝袋的容量為10-50kg比較合適。2.乳酸菌擴大培養(yǎng)乳酸菌一般選用嗜熱鏈球菌，也稱為唾液鏈球菌嗜熱亞種、發(fā)酵乳桿菌和植物乳桿菌等常用的發(fā)酵飼料生產用乳酸菌。將乳酸菌種子液接種于培養(yǎng)基中（接種量為0.5%），在35條件下厭氧培養(yǎng)1014h，得到擴大培養(yǎng)液，乳酸菌的濃度為2.04.01011cfu/g。菌液中干物質的含量為7.0%左右（即

60、菌液的含水量為93.0%）。培養(yǎng)基按照如下方法配制：將紅糖（或白砂糖）溶解于無抗生素（或抗生素殘留量不超過0.5mg/kg）的純牛奶中，得到乳酸菌培養(yǎng)基。將培養(yǎng)基在95105條件下消毒1015min，冷卻至40以下。3.干燥載體與乳酸菌菌液混合 麥粉與乳酸菌菌液混合，得到的混合物即為乳酸菌劑制成品。將制備得到的乳酸菌劑成品裝于致密性很好的包裝袋中，抽真空密封。菌劑的保存期及活菌損失情況將真空包裝的菌劑置于常溫中保存，在保存時間為1,3,6個月時，分別菌劑中活菌損失情況。我們進行了6次實際生產試驗，結果如表2-11至2-17。表2-11 嗜熱鏈球菌制劑保存試驗 （ 25，真空保存，含水量11.2