高產(chǎn)淀粉酶菌株的分離鑒定

1、高產(chǎn)淀粉酶菌株的分離鑒定第1頁，共13頁，2022年，5月20日，19點17分，星期四實驗?zāi)康恼莆胀寥罉悠分校⑸锞N分離和篩選技術(shù)的實驗設(shè)計方法。掌握富集、平板稀釋涂布法、分離篩選產(chǎn)淀粉酶菌株的基本原理。初步掌握從土壤樣品中分離篩選產(chǎn)淀粉酶菌株的基本技術(shù)。第2頁，共13頁，2022年，5月20日，19點17分，星期四 實驗原理鑒別培養(yǎng)基是用于鑒別不同類型微生物的培養(yǎng)基。在培養(yǎng)基中加入某種特殊化學物質(zhì)，某種微生物在培養(yǎng)基中生長后能產(chǎn)生某種代謝產(chǎn)物，而這種代謝產(chǎn)物可以與培養(yǎng)基中的特殊化學物質(zhì)發(fā)生特定的化學反應(yīng)，產(chǎn)生明顯的特征性變化，根據(jù)這種變化可將該種微生物與其他微生物區(qū)分開來。第3頁，共13

2、頁，2022年，5月20日，19點17分，星期四 實驗材料及器材 錐形瓶、移液管、試管、接種環(huán)、涂布棒、培養(yǎng)皿、天平、滅菌鍋、培養(yǎng)箱、搖床、離心機等第4頁，共13頁，2022年，5月20日，19點17分，星期四 菌源及培養(yǎng)基菌源：選擇含淀粉豐富的土壤為最佳。培養(yǎng)基：平板篩選培養(yǎng)基: 可溶性淀粉2 % 、蛋白胨1 % 、NaCl 0 .5 % 、牛肉膏 0 .5 % 、瓊脂粉1.52% 、121度滅菌20分鐘.分離培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基：采用牛肉膏蛋白胨固體培養(yǎng)基加0.2%可溶性淀粉，即牛肉膏3g、蛋白胨10g、NaCl 5g、可溶性淀粉2g溶于1000mL蒸餾水中， pH調(diào)至7.2，121滅菌15m

3、in。 第5頁，共13頁，2022年，5月20日，19點17分，星期四 實驗步驟樣品稀釋：稱取土壤樣品1g溶于9mL 無菌水中 ,或水樣品 5mL 溶于45mL無菌水中 ,分別用無菌水梯度稀釋至 1 10 7倍。分離：取 1 10 5、1 106 、1 107 稀釋液涂布于平板篩選培養(yǎng)基表面，37培養(yǎng)72h。等長出菌落后，根據(jù)菌落不同挑取菌落進行保存并編號。 初步篩選：將檢測試劑（路戈氏碘液）加入到平板中，涂布均勻，菌落周圍形成水解圈的菌株即是產(chǎn)淀粉酶的菌株，記住其編號，以便進行下一步的復篩。 培養(yǎng)離心：在初篩中分離到的產(chǎn)淀粉酶的菌株活化后接入裝有分離培養(yǎng)基液體培養(yǎng)基的三角瓶中，對其于30搖床

4、進行發(fā)酵培養(yǎng)48h，對發(fā)酵液8000rpm離心5min，取上清液。再次篩選：在檢測培養(yǎng)基上面打孔后，將上清液加入到孔中后放入恒溫箱中靜置8h后取出,把路戈氏碘液加入到平板中，涂布均勻，水解圈大的其發(fā)酵液上清中的淀粉酶的活性就高，取活性最高的菌株作為目的菌株，對其進行培養(yǎng),即得到高產(chǎn)淀粉酶的菌株。 第6頁，共13頁，2022年，5月20日，19點17分，星期四 形態(tài)觀察高產(chǎn)淀粉酶的菌一般為芽孢桿菌對其形態(tài)觀察：菌落較大 ,中央有皺褶,圓形、規(guī)則、無光澤、灰白色 ,不透明。顯微鏡觀察菌體特征:桿狀 ,直或接近直 ,多數(shù)運動 ,有側(cè)生鞭毛 ,芽孢中生 ,橢圓形。第7頁，共13頁，2022年，5月20

5、日，19點17分，星期四 注意事項要嚴格按照培養(yǎng)基配方配制培養(yǎng)基，防止雜菌污染。觀察結(jié)果時要注意滴加藥量和反應(yīng)時間。嚴格無菌操作，防止污染情況的發(fā)生。分離菌株時，稀釋度不夠?qū)е滤馊φ尺B。第8頁，共13頁，2022年，5月20日，19點17分，星期四 結(jié)果與討論1 稀釋度對土壤細菌菌落形成的影響 用營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基分別培養(yǎng)不同稀釋度的土壤菌懸液，結(jié)果表明（圖1） ，10-2 10-3 10-4 10-5 10-6稀釋度中形成的菌落數(shù)分別為240 124 51 33 25，其相差的倍數(shù)分別為1.9 2.4 1.5 1.3，即不同菌懸液稀釋度之間沒有嚴格的比例關(guān)系，其原因可能是操作不當和本實驗的精確

6、度本來就不高。第9頁，共13頁，2022年，5月20日，19點17分，星期四2 土壤中有淀粉酶活性細菌的比例 為了了解土壤中含淀粉酶菌株的比例，選擇了營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基培養(yǎng)基由于淀粉培養(yǎng)基中只有淀粉為唯一碳源，因此，在該培養(yǎng)基中能生長良好的細菌一般均具淀粉酶活性。試驗的結(jié)果如表1所示，按照10-2,10-3,10-4,10-5,10-6 稀釋度中的菌落數(shù)計算，所采集土壤樣品中具淀粉酶活性的細菌比例在1:2.5 1:2.2 1:1.3 1:1.6 1:2.2 。第10頁，共13頁，2022年，5月20日，19點17分，星期四3 菌懸液加熱處理對淀粉酶活性細菌比例的影響將菌懸液進行加熱100處理，然后

7、按常規(guī)方法作稀釋和培養(yǎng)，結(jié)果表明：加熱可顯著降低菌懸液中的細菌數(shù)量，但具有淀粉酶活性的細菌比例由52提高到74，加熱處理可顯著提高菌懸液中淀粉酶活性細菌的比例說明淀粉酶活性細菌的最適生長溫度比其他細菌的最適生長溫度高，過高的溫度抑制了其他細菌的生長。第11頁，共13頁，2022年，5月20日，19點17分，星期四4 淀粉酶活性細菌的獲得與初步篩選 將在淀粉培養(yǎng)基中生長的細菌菌落分別進行進一步的劃線分離，挑取單個生長的菌落接種到試管中保存，然后在含淀粉培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿中加入碘液，觀察透明圈的大小，初步選定透明圈較大的細菌菌落為淀粉酶活性較高的菌株。第12頁，共13頁，2022年，5月20日，19點17分，星期四 結(jié)論 通過本次試驗我們了解到菌懸液稀釋度對土壤細菌菌