發(fā)酵工業(yè)菌種

1、第二章 發(fā)酵工業(yè)菌種 一、常用的工業(yè)微生物二、發(fā)酵工業(yè)菌種篩選的原則與基本技術(shù)三、發(fā)酵工業(yè)菌種改良最常用的工業(yè)微生物細(xì)菌醋桿菌屬的醋化醋桿菌、弱氧化醋桿菌乳酸桿菌枯草桿菌丙酮丁醇梭菌大腸桿菌谷氨酸棒狀桿菌最常用的工業(yè)微生物放線菌 灰色鏈霉菌金霉素鏈霉菌紅霉素鏈霉菌衣氏放線菌內(nèi)氏放線菌最常用的工業(yè)微生物酵母菌釀酒酵母假絲酵母屬產(chǎn)朊假絲酵母、解脂假絲酵母、熱帶假絲酵母畢赤酵母屬、漢遜酵母屬最常用的工業(yè)微生物霉菌曲霉屬米曲霉黑曲霉青霉屬青霉菌：點(diǎn)青霉、產(chǎn)黃青霉桔青霉根霉屬德氏根霉米根霉、小麥曲根霉紅曲霉屬紫紅曲霉最常用的工業(yè)微生物放線菌鏈霉菌屬小單孢菌屬地中海諾卡氏菌米蘇里游動(dòng)放線菌 未培養(yǎng)微生物定

2、義：指迄今所采用的微生物純培養(yǎng)分離及培養(yǎng)方法還未獲得純培養(yǎng)的微生物，其在自然環(huán)境微生物群落中占有非常高的比例，約為99。研究方法 模擬自然培養(yǎng)法: 原位培養(yǎng)、培養(yǎng)條件優(yōu)化、單 細(xì)胞操作 宏基因組分析法 ：通過對(duì)未培養(yǎng)微生物的宏基因組分析來利用未培養(yǎng)微生物的基因資源，可以不對(duì)未培養(yǎng)微生物進(jìn)行純培養(yǎng)而直接在基因水平上進(jìn)行開發(fā)利用未培養(yǎng)微生物二、發(fā)酵工業(yè)菌種分離篩選原則與基本技術(shù)（一）發(fā)酵工業(yè)菌種篩選的總趨勢與要求（二）分離篩選原理與技術(shù)（三）應(yīng)用舉例 1. 菌種選擇的總趨勢野生菌變異菌自然選育代謝控制育種誘發(fā)基因突變基因重組的定向育種 2. 菌種選擇的要求 能在廉價(jià)原料制成的培養(yǎng)基上迅速生長，且生

3、成的目的產(chǎn)物產(chǎn)量高、易于回收； 生長速度和反應(yīng)速度較快，發(fā)酵周期較短；培養(yǎng)條件易于控制；抗噬菌體及雜菌污染的能力強(qiáng)；2. 菌種選擇的要求（續(xù)）菌種不易變異退化；對(duì)放大設(shè)備的適應(yīng)性強(qiáng)；菌種不是病原菌，不產(chǎn)生任何有害的生物活性物質(zhì)和毒素。（二）分離篩選原理與技術(shù)1. 篩選的指導(dǎo)思想2. 分離篩選工作在實(shí)際中應(yīng)用的幾個(gè)方面3. 新種分離篩選原理與技術(shù)1. 篩選的兩種指導(dǎo)思想 先分離純化，再結(jié)合工藝要求進(jìn)行篩選。分離純化同時(shí)富于篩選條件，一步得出所需菌株。結(jié)果有兩種可能：獲得適于工業(yè)發(fā)酵菌株只獲得選育所需的出發(fā)菌株2. 分離篩選工作在實(shí)際中應(yīng)用的幾個(gè)方面從被污染的生產(chǎn)及科研用菌中分離目的菌； 生產(chǎn)中長

4、期使用的菌種的定期分離篩選 ；從各種育種方法處理的微生物材料中分離篩選適于工業(yè)目的的優(yōu)良菌株 ；從已知菌種和大自然中分離新菌株尋找新的發(fā)酵產(chǎn)品的產(chǎn)生菌；尋找老產(chǎn)品的新的優(yōu)良菌株。從保藏機(jī)構(gòu)獲取菌種進(jìn)行分離篩選有兩個(gè)好處： 經(jīng)濟(jì)性 指導(dǎo)性設(shè)計(jì)篩選方案時(shí)必須考慮兩個(gè)要點(diǎn) 選擇性靈敏度3. 新種分離與篩選的步驟 調(diào)查研究（包括資料查閱） 試驗(yàn)方案設(shè)計(jì) 含微生物樣品的采集 （如何使樣品中所含微 生物的可能性大？） 樣品預(yù)處理 （如何在后續(xù)的操作中使這種可 能性實(shí)現(xiàn)） 菌種分離 根據(jù)目的菌株及其產(chǎn)物特點(diǎn)分 選擇性分離方法 隨機(jī)分離方法 (定向篩選選擇壓力) (用篩選方案- 檢測系統(tǒng)進(jìn)行間接分離）富集液體

5、培養(yǎng) 固體培養(yǎng)基條件培養(yǎng) (初篩) 菌種純化 復(fù)篩 菌種純化初步工藝條件摸索 再復(fù)篩 生產(chǎn)性能測試 較優(yōu)菌株1-3株保藏及進(jìn)一步做生產(chǎn)試驗(yàn) 某些必要試驗(yàn)和 或作為育種的出發(fā)菌株 毒性試驗(yàn)等 含微生物樣品的采集采樣時(shí)應(yīng)注意的問題:土壤微生物的分布采土深度土壤植被情況采樣季節(jié)土壤的酸堿度對(duì)于分離篩選新菌種，還存在另兩個(gè)選擇標(biāo)準(zhǔn)：土壤來源廣泛在已適應(yīng)相當(dāng)苛刻環(huán)境壓力的微生物類群中尋找新菌種樣品的預(yù)處理目的：提高分離效率方法：物理方法：熱處理；膜過濾法；離心法化學(xué)方法誘餌法分離方法的選擇 根據(jù)目的菌有無選擇性特征來選擇分離方法菌種的營養(yǎng)特征獨(dú)特 生長特征獨(dú)特 無選擇性特征 根據(jù)產(chǎn)物的特征進(jìn)行 隨機(jī)分離

6、 選擇性分離的關(guān)鍵：生長培養(yǎng)條件的選擇與控制，從而實(shí)現(xiàn)定向富集篩選。選擇性分離 選擇性分離原理和技術(shù)生長條件的選擇與控制原理控制營養(yǎng)成分 控制培養(yǎng)基酸堿度 添加抑制劑 控制培養(yǎng)溫度 控制通氣條件 選擇性分離技術(shù)富集液體培養(yǎng)技術(shù)固體培養(yǎng)技術(shù)施加選擇壓力，進(jìn)行定向篩選 A.富集液體培養(yǎng)增加混合菌群中所需菌株數(shù)量的一種技術(shù)技術(shù)特點(diǎn)：給混合菌群提供一些有利于目的菌株生長或不利于目的菌以外的其他菌型生長的條件培養(yǎng)方式分批培養(yǎng)方式：以最大比生長速率 （max）篩選，存在選擇壓力的控制、移種時(shí)間和次數(shù)等問題連續(xù)培養(yǎng)方式：以比生長速率（ ）篩選 ABS0基質(zhì)濃度對(duì)A、B兩種菌的比生長速率（）的影響 當(dāng)SS0時(shí)

7、，富集什么菌株？連續(xù)富集培養(yǎng)技術(shù)分離菌株的優(yōu)點(diǎn) 分離的菌株特別適合連續(xù)發(fā)酵生產(chǎn)過程有利于分離具有某種工業(yè)生產(chǎn)特性的菌株可以篩選出能共生的穩(wěn)定混合培養(yǎng)物B. 固體培養(yǎng)技術(shù)常用于分離某些酶產(chǎn)生菌 選擇壓力：在選擇培養(yǎng)基中加入所需酶的基質(zhì)常用的幾種菌種分離方法平板劃線分離法稀釋分離法簡單平板分離法涂布分離法毛細(xì)管分離法小滴分離法菌種初篩、復(fù)篩施加選擇性壓力：壓力的選擇 營養(yǎng) 環(huán)境條件隨機(jī)分離法：抑菌圈法（抗生素產(chǎn)生菌的分離） 生長圈分離法（有相對(duì)營養(yǎng)缺陷的細(xì)菌） 變色圈法（果膠酶產(chǎn)生菌、生脂類菌）透明圈法（產(chǎn)生堿性蛋白酶的芽孢桿菌）隨機(jī)分離原理與技術(shù)從產(chǎn)物入手，通過設(shè)計(jì)高產(chǎn)培養(yǎng)基和建立快速靈敏專一的

8、篩選方法，從隨機(jī)分離的菌落中篩選出所需的目的菌。技術(shù)關(guān)鍵：產(chǎn)物合成條件的選擇與控制及相應(yīng)篩選方法的確定。隨機(jī)分離技術(shù)舉例 抗生素產(chǎn)生菌的篩選藥理活性化合物產(chǎn)生菌的篩選生長因子產(chǎn)生菌的篩選多糖產(chǎn)生菌的篩選高產(chǎn)培養(yǎng)基設(shè)計(jì)的幾個(gè)原則 制備一系列的培養(yǎng)基，其中有各種類型的養(yǎng)分成為生長限制因素；使用一聚合或復(fù)合形式的生長限制養(yǎng)分；避免使用容易同化的碳源或氮源，防止分解代謝物阻遏；確定含有所需的輔因子（Co2+,Mg2+,Mn2+,Fe2+）；使用pH緩沖劑以減少pH變化；前體、促進(jìn)劑及抑制劑的采用?？股禺a(chǎn)生菌的篩選篩選模型：試驗(yàn)菌篩選方法： 鋪菌法 復(fù)印平板法液體培養(yǎng)篩選 抗藥性篩選篩選模型：氨芐青霉

9、素和-內(nèi)酰胺酶產(chǎn)生菌（克雷白氏菌）協(xié)同 I II無試樣時(shí)（不含棒酸時(shí)），I對(duì)II菌作用不大有試樣時(shí)（含棒酸時(shí)），I對(duì)II菌恢復(fù)藥效，棒酸抑制水解酶活性 固體培養(yǎng)篩選試驗(yàn)菌 代表微生物類型金黃色葡萄球菌209p 革蘭氏陽性球菌枯草桿菌6633 革蘭氏陽性桿菌 大腸桿菌 革蘭氏陰性腸道細(xì)菌恥垢分枝桿菌607 結(jié)核桿菌白色念珠菌 酵母狀真菌 青霉菌 絲狀真菌 藥理活性化合物產(chǎn)生菌的篩選 藥理活性化合物是指能抑制人類代謝中某一個(gè)關(guān)鍵酶的微生物產(chǎn)物即酶抑制劑，從而達(dá)到治療的目的。 篩選模型：目標(biāo)酶生長因子產(chǎn)生菌的篩選 篩選模型：營養(yǎng)缺陷型試驗(yàn)菌 篩選方法：利用被分離的微生物產(chǎn)物能否促進(jìn)營養(yǎng)缺陷型試驗(yàn)菌生

10、長氨基酸產(chǎn)生菌的篩選 樣品 預(yù)處理 初篩（除真菌） 在分離平板上生長獲得多個(gè)單菌落 復(fù)印平板（copy 法） 平板培養(yǎng)，其中有產(chǎn)生氨基酸的菌落分泌氨基酸 對(duì)應(yīng)到copy前相應(yīng) u.v線殺死長好的菌落 位置，找到目的菌落再鋪上一層含營養(yǎng)缺陷型試驗(yàn)菌的瓊脂 培養(yǎng)后 產(chǎn)氨基酸菌落周圍有生長圈 目的菌落進(jìn)行液體培養(yǎng)， 對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行定量測定 篩選產(chǎn)物含量高的菌株多糖產(chǎn)生菌的篩選取樣特點(diǎn)：碳水化合物工業(yè)的廢棄物篩選方案：從菌落外觀判斷，選擇外觀呈粘液狀的菌落，然后根據(jù)液體培養(yǎng)測定多糖含量來篩選高產(chǎn)菌。細(xì)菌分離：以乳酸菌為例 取未成熟的醬醪樣品1g至無菌磨口瓶中 加麥芽汁至瓶口處，封塞，25培養(yǎng)24-48h培

11、養(yǎng)基中長出絹絲狀波動(dòng)物，鏡檢 桿狀，陽性染色 初步斷定乳酸菌 用選擇性培養(yǎng)基分批富集培養(yǎng)2-3代稀釋分離法分離單菌落，培養(yǎng)基為含麥芽汁、CaCO3的瓊脂培養(yǎng)基 根據(jù)透明圈挑選菌落 性能測定（鏡檢桿狀，染色陽性；乳酸紙層析鑒定） Rf值定性 （有機(jī)酸呈黃斑點(diǎn)） 乳酸生成量測定（滴定法）放線菌的分離：以產(chǎn)鏈霉素菌種的分離為例（從退化菌種中篩選） 取工業(yè)發(fā)酵液（含孢子）樣品1環(huán)放入帶玻璃珠的裝有10ml 無菌水的小三角瓶中，搖勻采用稀釋法制平板，獲取單菌落 斜面保藏 高產(chǎn)菌恢復(fù)根據(jù)高產(chǎn)菌的特點(diǎn)，選擇目的菌落 放大培養(yǎng)，發(fā)酵液性能測試真菌的分離篩選：以啤酒酵母的分離為例 取發(fā)酵液少許以10倍稀釋成10

12、-1-10-7 稀釋分離法 取0.1ml 加入固體培養(yǎng)基鋪平皿（2） 在麥芽汁固體培養(yǎng)基上，25培養(yǎng)48-72h 形態(tài)篩選 根據(jù)正常株特點(diǎn)進(jìn)行挑選，接種斜面?zhèn)溆?純化，采用平板分離法進(jìn)一步純化，至少反復(fù)三次 生成子囊孢子速度測定 發(fā)酵力測定 性能測定 熱死溫度測定 凝集力測定 雙乙酰含量測定菌種選育改良的具體目標(biāo)提高目標(biāo)產(chǎn)物的產(chǎn)量 提高目標(biāo)產(chǎn)物的純度，減少副產(chǎn)物 改良菌種性狀，改善發(fā)酵過程 改變生物合成途徑，以獲得高產(chǎn)的新產(chǎn)品菌種的鑒定方法經(jīng)典的分類鑒定方法：形態(tài)學(xué)特征；生理生化特征；血清學(xué)實(shí)驗(yàn)與噬菌體分型氨基酸順序和蛋白質(zhì)分析 現(xiàn)代分類鑒定方法：微生物遺傳型鑒定 細(xì)胞化學(xué)成分特征分類法；數(shù)值

13、分類法 菌種選育改良的具體目標(biāo)提高目標(biāo)產(chǎn)物產(chǎn)量提高目標(biāo)產(chǎn)物的純度，減少付產(chǎn)物改良菌種性狀，改善發(fā)酵過程改變生物合成途徑，以獲得高產(chǎn)的新產(chǎn)品菌種代謝生理與分子生物學(xué)初級(jí)代謝與次級(jí)代謝代謝調(diào)控機(jī)制:酶合成的調(diào)節(jié)（誘導(dǎo) 阻遏） 酶活性的調(diào)節(jié)（激活 抑制）工業(yè)菌種的育種包括以下3個(gè)步驟：在不影響菌種活力的前提下，有益基因型的引入希望基因型的選出改良菌種的評(píng)價(jià)選擇育種方法時(shí)考慮的因素待改良性狀的本質(zhì)與發(fā)酵工藝的關(guān)系對(duì)這特定菌種的遺傳生物化學(xué)方面認(rèn)識(shí)的明了程度經(jīng)濟(jì)費(fèi)用工業(yè)菌種的改良途徑解除或繞過代謝途徑中的限速步驟增加錢提物的濃度改變代謝途徑，減少無用副產(chǎn)品的生成以及提高菌種對(duì)高濃度的有潛在毒性的底物、前

14、體或產(chǎn)品的耐受力抑制或消除產(chǎn)品分解酶改進(jìn)菌種外分泌產(chǎn)品的能力消除代謝產(chǎn)品的反饋抑制 發(fā)酵工業(yè)菌種改良方法常規(guī)育種(誘變育種)細(xì)胞工程育種 基于代謝調(diào)節(jié)的育種技術(shù) 基因工程育種 蛋白質(zhì)工程育種 代謝工程育種自然選育操作步驟單細(xì)胞懸浮液制備平板分離挑選單菌落發(fā)酵實(shí)驗(yàn)誘變育種誘變育種:以誘發(fā)突變?yōu)榛A(chǔ)的育種是迄今為止國內(nèi)外提高菌種產(chǎn)量，性能的主要途徑用各種物理化學(xué)因素人工誘發(fā)基因突變進(jìn)行的篩選稱為誘變育種凡能誘發(fā)微生物基因突變，使突變頻率超過自發(fā)突變頻率的物理因子或化學(xué)物質(zhì)稱為誘變劑誘變育種的步驟出發(fā)菌株的選擇處理菌懸浮液的制備誘變處理中間培養(yǎng)分離和篩選誘變育種的分離和篩選篩選分為初篩和復(fù)篩，初篩以

15、迅速篩選出大量的達(dá)到初步要求的分離菌落未目的，以量為主。復(fù)篩則是精選，以質(zhì)為主，液就是以精確度為主初篩可以在平皿上直接以菌落的代謝產(chǎn)物與某些染料或基質(zhì)的作用形成的變色圈或透明圈的大小來參加復(fù)篩者，而將90%的菌落淘汰。在數(shù)量減少后就要仔細(xì)比較參加復(fù)篩和在復(fù)篩的菌株，在一會(huì)的復(fù)篩階段還應(yīng)不斷結(jié)合自然分離進(jìn)行純化菌株。雜交育種雜交育種是將兩個(gè)基因型不同的菌株經(jīng)吻合使遺傳物質(zhì)重新組合，從中分離篩選出具有新型狀的菌株。雜交育種的遺傳標(biāo)記：營養(yǎng)缺陷型標(biāo)記；抗性標(biāo)記；溫度敏感性標(biāo)記等賴氨酸生產(chǎn)菌種的選育改良思路出發(fā)菌株：黃色短桿菌、谷氨酸棒桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌育種思路 1.優(yōu)先合成的轉(zhuǎn)換滲漏缺陷型的選育

16、2.切斷支路代謝營養(yǎng)缺陷型的選育：高絲氨酸缺陷型 3.抗結(jié)構(gòu)類似物突變株的選育：AEC 4.解除代謝互鎖：Leu- 、 抗Leu結(jié)構(gòu)類似物、 喹啉s 、 苯醌s 5.增加前體物的合成和阻塞副產(chǎn)物的生成： Ala-、抗Asp結(jié)構(gòu)類似物 選育適宜的CO2固定酶/TCA循環(huán)酶活性比突變株 6.改善細(xì)胞膜的透過機(jī)能 7. 選育溫度敏感突變株 8. 應(yīng)用細(xì)胞工程和基因工程育種選育適宜的CO2固定酶/TCA循環(huán)酶活性比突變株賴氨酸合成中間代謝有以下兩條途徑：通過TCA循環(huán) 葡萄糖 丙酮酸 草酰乙酸 天冬氨酸 賴氨酸 通過磷酸烯醇丙酮酸羧化反應(yīng) 葡萄糖 磷酸烯醇 草酰乙酸 天冬氨酸 式丙酮酸 丙酮酸 賴氨酸

17、 代謝工程的定義利用多基因重組技術(shù)有目的地對(duì)細(xì)胞代謝途徑進(jìn)行修飾、改造，改變細(xì)胞特性，并與細(xì)胞基因調(diào)控、代謝調(diào)控及生化工程相結(jié)合，為實(shí)現(xiàn)構(gòu)建新的代謝途徑，生產(chǎn)特定目的產(chǎn)物而發(fā)展起來的一個(gè)新的學(xué)科領(lǐng)域。又稱作途徑工程，是多基因的基因工程。 代謝工程發(fā)展基礎(chǔ) 代謝網(wǎng)絡(luò)理論：是把細(xì)胞的生化反應(yīng)以網(wǎng)絡(luò)整體，而不是孤立地來考慮。代謝網(wǎng)絡(luò)分流處的代謝產(chǎn)物稱為節(jié)點(diǎn)，其中對(duì)終產(chǎn)物合成起決定作用的少數(shù)節(jié)點(diǎn)稱為主節(jié)點(diǎn)。根據(jù)節(jié)點(diǎn)下游分支的可變程度，節(jié)點(diǎn)分為：柔性節(jié)點(diǎn)： 解除一個(gè)分支的反饋抑制可提高該分支下游產(chǎn)物的產(chǎn)量。半柔性節(jié)點(diǎn)：須降低主分支的酶活并同時(shí)提高次分支的酶活或解除其反饋抑制，才可提高次分支下游產(chǎn)物的產(chǎn)量

18、。剛性節(jié)點(diǎn)：其下游各分支的比例不易改變。 代謝工程發(fā)展基礎(chǔ)相依網(wǎng)絡(luò)：代謝網(wǎng)絡(luò)中各主節(jié)點(diǎn)集中于產(chǎn)物，為了避免中間物的過量積累，各分支的代謝流都必須保持平衡，各分支的分流相等，各節(jié)點(diǎn)的重要性相同。獨(dú)立網(wǎng)絡(luò)：代謝網(wǎng)絡(luò)的主節(jié)點(diǎn)不集中，可以通過對(duì)代謝的修飾來影響產(chǎn)物的產(chǎn)量,其對(duì)代謝修飾的應(yīng)答能力，取決于各節(jié)點(diǎn)的剛?cè)嵝约捌湮恢谩?S I P S P B B1 B2相依網(wǎng)路獨(dú)立網(wǎng)路（三）代謝工程育種思路1. 改變代謝流：改變分支代謝途徑的流向，阻斷有害代謝產(chǎn)物的合成。（1）加速限速反應(yīng)（2）改變分支代謝途徑流向：提高代謝分支點(diǎn)的某一分支代謝途徑酶系的活力，在與另外的分支代謝途徑的競爭中占有優(yōu)勢，可以提高目的代謝末端產(chǎn)物的產(chǎn)量。（3）構(gòu)建代謝旁路（4）改變能量代謝途徑 代謝工程育種思路2. 擴(kuò)展代謝