華貴櫛孔扇貝富硒蛋白粉的酶法制備工藝優(yōu)化及其營養(yǎng)評(píng)價(jià)

1、PAGE PAGE - 14 -華貴櫛孔扇貝富硒蛋白粉的酶法制備工藝優(yōu)化及其營養(yǎng)評(píng)價(jià)硒是人體必需微量元素之一1，主要以硒結(jié)合蛋白及含硒肽等形式在生物體內(nèi)發(fā)揮其生理功能，表現(xiàn)為抗癌、增強(qiáng)免疫力及促進(jìn)生長發(fā)育等2。自1817年硒元素被發(fā)現(xiàn)至今，逐漸成為熱點(diǎn)研究課題；早期研究以硒蛋白的作用機(jī)理3、硒的代謝機(jī)制4為主，近年來富硒食品受到關(guān)注，富硒大米5、富硒茶6等研究不斷深入，含硒蛋白及含硒肽的功能活性被挖掘，同時(shí)研究表明含硒小分子肽更利于人體吸收。相關(guān)研究聚焦于硒的活性分析，但富硒肽類的功能營養(yǎng)產(chǎn)品的研究與開發(fā)較少，而含硒量高且產(chǎn)量大的主料是發(fā)富硒營養(yǎng)產(chǎn)品的關(guān)鍵。前期研究結(jié)果顯示湛江海區(qū)產(chǎn)的華貴櫛孔

2、扇貝可食用部位硒含量1.39g/g(干基)，遠(yuǎn)高于食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)預(yù)包裝食品營養(yǎng)標(biāo)簽通則(GB280502022)富硒食品標(biāo)準(zhǔn)(0.15g/g)。據(jù)2022漁業(yè)統(tǒng)計(jì)年鑒的數(shù)據(jù)，2022年扇貝年產(chǎn)量達(dá)175萬t，僅次于牡蠣及蛤類。廣東湛江作為華貴櫛孔扇貝主產(chǎn)區(qū)之一，產(chǎn)量達(dá)11萬t，具有獨(dú)特的資源優(yōu)勢(shì)，為貝類富硒產(chǎn)品的研究與開發(fā)提供原料保障。華貴櫛孔扇貝富硒蛋白粉的開發(fā)能拓展其市場前景，使華貴櫛孔扇貝資源的價(jià)值得到充分體現(xiàn)。當(dāng)前，將原料酶解制備蛋白酶解產(chǎn)物是開發(fā)易吸收蛋白類產(chǎn)品的主要途徑，如涂曉玲7的研究表明藍(lán)圓鲹魚酶解蛋白粉具有較高的營養(yǎng)價(jià)值及波紋巴非蛤酶解蛋白粉具有氨基酸種類齊全，營養(yǎng)豐富的特

3、點(diǎn)8。本文通過酶解法利用華貴櫛孔扇貝制備富硒蛋白粉，并對(duì)其進(jìn)行營養(yǎng)評(píng)價(jià)，為華貴櫛孔扇貝富硒蛋白粉的研究與開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。1材料與方法1.1材料與試劑華貴櫛孔扇貝于2022年9月購自于湛江市霞山工農(nóng)市場，開殼取肉去內(nèi)臟團(tuán)后，洗凈瀝干，分裝-20貯藏備用。枯草桿菌中性蛋白酶(酶活100U/mg，以下稱中性蛋白酶)、動(dòng)物蛋白酶(67U/mg)、木瓜蛋白酶(70U/mg)、菠蘿蛋白酶(16U/mg)、胰蛋白酶(58U/mg)、Protamex1.6(63U/mg)，南寧市龐博生物工程有限公司；抑肽酶(6511.51Da，CAS號(hào)9087-70-1)、溶菌酶(2899.27Da，CAS號(hào)12650-8

4、8-3)、維生素B12(1355.37Da，CAS號(hào)68-19-9)、L-酪氨酸(181.19Da，CAS號(hào)60-18-4)，美國Sigma公司；甲酸、乙腈為色譜純，硝酸為優(yōu)級(jí)純，其他試劑為分析純。1.2儀器與設(shè)備FE28型pH計(jì)，梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司；XP205型分析天平，上海天平儀器廠；7500cx型ICP-MS，美國Agilent公司；Waters-e2694高效液相色譜儀，美國Waters公司；XevoRP-HPLC-Q-TofMS質(zhì)譜，美國Waters公司；DX-7000型噴霧干燥機(jī)，東京理化器械株式會(huì)社。1.3實(shí)驗(yàn)方法1.3.1華貴櫛孔扇貝酶解產(chǎn)物的制備將華貴櫛孔扇貝

5、肉經(jīng)過4冰箱中冷藏解凍，用打漿機(jī)將貝肉打成肉糜，準(zhǔn)確稱取20.00g肉糜于燒杯中加入一定質(zhì)量體積比的蒸餾水，以8000r/min均質(zhì)90s，用1mol/L的NaOH或HCl調(diào)節(jié)蛋白酶解所需pH，加入適量的蛋白酶并設(shè)置相應(yīng)酶解溫度，酶解過程中維持pH穩(wěn)定；酶解結(jié)束后，95100下滅酶10min，混合液4離心(4500r/min，10min)，取上清液備用。1.3.2華貴櫛孔扇貝水解蛋白酶的選擇據(jù)GUERRA等9文獻(xiàn)報(bào)道并結(jié)合課題組前期研究，選擇中性蛋白酶(最適pH7.0，后以數(shù)字表示)、木瓜蛋白酶(6.5)、動(dòng)物的蛋白酶(6.5)、胰蛋白酶(7.0)、Protamex1.6(7.0)和菠蘿蛋白酶

6、(7.0)6種蛋白酶分別對(duì)華貴櫛孔扇貝進(jìn)行酶解；按1.3.1調(diào)節(jié)各酶所需pH，加酶量3000U/g，料液比13，溫度50酶解3h，以水解度(degreeofhydrolysis，DH)為測定指標(biāo)，進(jìn)行水解蛋白酶的篩選。水解度計(jì)算如公式(1)所示：(1)式中：X為水解度，%；A為酶解液氨基氮含量，g/100g(下同)；B為原料游離氨基氮含量；C為原料總氮含量；D為原料中非蛋白氮含量。酶解液及游離氨基氮測定采用中性甲醛電位滴定法測定。1.3.3華貴櫛孔扇貝中性蛋白酶單因素試驗(yàn)根據(jù)1.3.2中選擇水解度最高的中性蛋白酶進(jìn)行單因素試驗(yàn)，探究中性蛋白酶酶解溫度、料液比及加酶量3個(gè)因素對(duì)華貴櫛孔扇貝水解度

7、的影響；設(shè)置酶解溫度40、45、50、55、60，料液比12、13、14、15、16，加酶量1000、2000、3000、4000、5000U/g，酶解pH7.0，酶解時(shí)間3h的酶解條件，比較不同條件對(duì)華貴櫛孔扇貝水解度的影響。1.3.4響應(yīng)面優(yōu)化華貴櫛孔扇貝酶解工藝在單因素的基礎(chǔ)上，設(shè)計(jì)加酶量，溫度，料液比3因素3水平試驗(yàn)，如表1所示，以華貴櫛孔扇貝蛋白水解度及酶解產(chǎn)物中硒溶出率(seleniumdissolutionrate，SDR)為指標(biāo)，計(jì)算如公式(2)所示：(2)式中：Y為硒溶出率，%；C為酶解液中硒含量，g/L；V為酶解液總體積，L；M為華貴櫛孔扇貝總硒含量，g/g；m為樣品稱重質(zhì)

8、量，g。酶解液中硒含量測定參考GB/T5009.2632022法。表1Box-Behnken實(shí)驗(yàn)因素水平表Table1Box-Behnkenexperimentalfactorleveltable1.3.5酶解時(shí)間對(duì)華貴櫛孔扇貝酶解工藝的影響在優(yōu)化工藝最優(yōu)條件下，比較不同酶解時(shí)間對(duì)蛋白水解度和硒溶出率的影響，酶解時(shí)間設(shè)置為2、3、4、5、6、7h，酶解pH為7.0。1.3.6華貴櫛孔扇貝酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布及肽質(zhì)譜分析HPSEC分析不同時(shí)間酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布情況。色譜柱：TSKgelG4000SW(7.5mm300mm)柱；檢測波長：214nm；流動(dòng)相速率：0.7mL/min；柱溫：室溫；進(jìn)

9、樣體積：20L；流動(dòng)相：50mmol/L磷酸鹽緩沖液，含0.3mol/LNaCl，pH7.0。標(biāo)準(zhǔn)品及樣品進(jìn)樣溶液配制，L-酪氨酸、維生素B12、溶菌酶、抑肽酶各取10mg，溶于10mL流動(dòng)相中，配制成1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)溶液(樣品根據(jù)實(shí)際情況稀釋)，過0.22m濾膜，標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量分布結(jié)果如圖1所示。以保留時(shí)間為橫坐標(biāo)，以lgMw為縱坐標(biāo)，得到標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：lgMw=-0.0807t+4.5606，R2=0.9806。1-抑肽酶；2-溶菌酶；3-維生素B12；4-L-酪氨酸圖1標(biāo)準(zhǔn)品分子質(zhì)量分布圖譜Fig.1Molecularweightdistributionmapofthereferenc

10、ematerials采用XevoRP-HPLC-Q-Tof-MS質(zhì)譜，分析不同酶解時(shí)間酶解產(chǎn)物中蛋白肽及氨基酸成分分布情況。酶解產(chǎn)物經(jīng)過截留量100Da透析袋脫鹽；流動(dòng)相為20%的乙腈水溶液(含0.1%FA)，流動(dòng)相流速0.5mL/min，色譜柱：WatersUPLCBEHC182.1mm50mm，1.7m。質(zhì)譜條件：離子化模式，ESI()；毛細(xì)管電壓，22.5kV(+)/(-)；一級(jí)錐孔電壓，20V；破碎電壓，2030V；源溫度，120；干燥氣流，700L/h；干燥氣溫度450。1.3.7基本成分測定水分含量：參考GB5009.32022食品中水分的測定；灰分含量：參考GB5009.4202

11、2食品中灰分的測定；蛋白質(zhì)含量：參考GB5009.52022食品中蛋白質(zhì)的測定；總糖含量：參考GB/T9695.312022肉制品總糖含量測定；脂肪含量：參考GB5009.52022食品中脂肪的測定。1.3.8酶解蛋白粉氨基酸測定通過質(zhì)譜測定酶解產(chǎn)物肽分布情況及硒溶出率比較，在工藝優(yōu)化的基礎(chǔ)上，以酶解時(shí)間6h制備酶解產(chǎn)物，濃縮至固形物含量為20%25%，進(jìn)行噴霧干燥制備粉劑。噴霧條件：蠕動(dòng)泵流速：約42.86mL/min；進(jìn)風(fēng)口溫度(1653)，出風(fēng)口溫度100，均質(zhì)化壓力0.5MPa；得到的蛋白粉參照GB5009.1242022食品中氨基酸的測定測定游離氨基酸和水解氨基酸含量。氨基酸營養(yǎng)評(píng)價(jià)

12、參考1973FAO/WHO成人標(biāo)準(zhǔn)模式，通過氨基酸評(píng)分(aminoacidscore，AAS)、氨基酸化學(xué)評(píng)分(chemicalscore，CS)及氨基酸系數(shù)評(píng)分(essentialaminoacidindex，EAAI)進(jìn)行評(píng)價(jià)，計(jì)算如公式(3)公式(5)所示，(3)(4)(5)式中：x，樣品中蛋白質(zhì)氨基酸含量，mg/g；y，F(xiàn)AO/WHO推薦模式下蛋白質(zhì)氨基酸含量，mg/g；z：參考標(biāo)準(zhǔn)全雞蛋蛋白質(zhì)氨基酸含量，mg/g。a：樣品中蛋白質(zhì)必需氨基酸含量，mg/g；b：參考標(biāo)準(zhǔn)全雞蛋蛋白質(zhì)必需氨基酸含量，mg/g；n：被比較的必需氨基酸數(shù)量。1.3.9酶解蛋白粉礦物質(zhì)組成測定參考GB10765

13、2022嬰兒配方食品測定酶解蛋白粉中礦物質(zhì)元素及重金屬鉛含量指標(biāo)：鈉、鉀、磷、鈣、鎂、鐵、鋅、硒、銅、錳及重金屬鉛，采用電感耦合等離子體質(zhì)譜法進(jìn)行礦物質(zhì)含量測定。1.4數(shù)據(jù)處理采用Excel2022進(jìn)行數(shù)據(jù)處理及方差分析，實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以表示，實(shí)驗(yàn)平行3次，Origin2022作圖；通過Design-Expert8.0.6進(jìn)行響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)及相關(guān)分析。2結(jié)果與分析2.1華貴櫛孔扇貝最佳水解蛋白酶的選擇選擇常用于水產(chǎn)品及肉制品小分子活性肽制備與提取的蛋白酶是制備目標(biāo)產(chǎn)物的關(guān)鍵，中性蛋白酶和菠蘿蛋白酶分別應(yīng)用于凡納冰對(duì)蝦10和羅非魚11ACE抑制肽的功能活性和活性作用機(jī)制的研究，動(dòng)物蛋白酶、木瓜蛋白酶應(yīng)

14、用于池蝶蚌酶解產(chǎn)物功能活性的研究12，胰蛋白酶在羅非魚肉酶解產(chǎn)物礦物離子結(jié)合能力的應(yīng)用研究13，以及Protamax復(fù)合蛋白酶應(yīng)用牡蠣風(fēng)味物質(zhì)的研究14，諸多研究表明以上蛋白酶對(duì)水產(chǎn)品蛋白水解能力顯著，因此選擇這6種蛋白酶應(yīng)用于華貴櫛孔扇貝蛋白粉的制備研究。硒在生物體內(nèi)以硒結(jié)合蛋白的形式存在，枯草桿菌中性蛋白酶是一種包含內(nèi)切酶和外切酶的復(fù)合蛋白酶15。由圖2可以看出，在含肌基質(zhì)蛋白較高的華貴櫛孔扇貝組織中，其蛋白水解度較高，達(dá)到28.53%，高于動(dòng)物蛋白酶的26.12%(P0.05)。其余4種蛋白酶對(duì)華貴櫛孔扇貝的水解能力較低，其水解度均低于25%。因此選擇中性蛋白酶用于后續(xù)研究。圖2不同蛋白

15、酶對(duì)華貴櫛孔扇貝蛋白水解能力的影響Fig.2EffectsofproteasesontheproteolyticabilityofChlamysnobilis注：不同字母表示差異顯著(P0.05)(下同)2.2中性蛋白酶酶解單因素試驗(yàn)結(jié)果2.2.1加酶量對(duì)華貴櫛孔扇貝水解度的影響如圖3-a所示，加酶量為10004000U/g時(shí)，水解度逐步增加，當(dāng)加酶量為4000U/g時(shí)水解度29.65%，達(dá)到最大值，加酶量繼續(xù)增加水解度反而略微下降，但較4000U/g時(shí)差異不顯著(P0.05)；當(dāng)加酶量達(dá)到5000U/g時(shí)，酶催化底物反應(yīng)接近飽和狀態(tài)。因此，結(jié)合生產(chǎn)成本選擇4000U/g作為響應(yīng)面優(yōu)化中心點(diǎn)。

16、2.2.2料液比對(duì)華貴櫛孔扇貝水解度的影響料液比的變化影響溶質(zhì)的分散程度，因此探究物料在溶液中合理的分散比例，能更好地促進(jìn)酶與底物的催化反應(yīng)進(jìn)行。如圖3-b所示，料液比為12時(shí)，水解度較低，僅為22.55%，此時(shí)物料含量為0.5g/mL，實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)溶液過于濃稠，待酶解反應(yīng)1h后逐漸呈現(xiàn)水液狀態(tài)，表明華貴櫛孔扇貝肉糜的分散比例低影響酶與底物的接觸，從而影響酶的水解能力；當(dāng)料液比增大到13時(shí)，物料含量0.33g/mL，水解度相較于料液比12迅速增加，增幅趨勢(shì)明顯(P0.05)；之后隨料液比的增加，水解度變化基本趨于穩(wěn)定(P0.05)伴小幅波動(dòng)。因此選擇料液比13作為優(yōu)化中心點(diǎn)。2.2.3溫度對(duì)華

17、貴櫛孔扇貝水解度的影響中性蛋白酶對(duì)溫度致敏，溫度過低或過高影響酶活性從而導(dǎo)致水解度降低。由圖3-c可以看出，中性蛋白酶水解能力隨溫度升高呈現(xiàn)出先增后減的趨勢(shì)，溫度為50時(shí)水解度達(dá)到最大值為28.84%，5055水解度有所降低；這一結(jié)果與呂振磊等16優(yōu)化紫貽貝工藝條件酶解溫度對(duì)水解度的影響趨勢(shì)一致。5560時(shí)水解度大幅降低，降幅相較前一個(gè)溫度跨度極為顯著(P0.05)，說明溫度升高導(dǎo)致酶活性降低或部分酶活性喪失。由4555，水解度先升后降的特點(diǎn)，可推測中性蛋白酶最適酶解溫度在這一范圍內(nèi)，因此選擇以50為優(yōu)化中心點(diǎn)。a-加酶量;b-料液比;c-溫度圖3不同條件對(duì)華貴櫛孔扇貝蛋白水解度的影響Fig.

18、3EffectsofdifferentconditionsontheDHofChlamysnobilisprotein2.3華貴櫛孔扇貝蛋白水解度及硒溶出率響應(yīng)面優(yōu)化Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果如表2所示，以水解度和硒溶出率為測定指標(biāo)。編碼實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行模型擬合和方差分析，結(jié)果見表3，可以看出DH及SDR擬合模型F值分別為51.95和101.21，模型極顯著(P0.01)，表明模型擬合度良好，擬合方程可用于模擬分析15。通過Design-Expert8.0.6得出水解度擬合方程為DH=30.57+2.50A+2.98B+1.23C+0.24AB+0.33AC+1.19BC-2.4

19、8A2-2.50B2-1.37C2，硒溶出率擬合方程為SDR=75.26+6.10A+6.23B+2.27C+1.31AB-0.087AC+3.38BC-3.75A2-4.19B2-2.11C2；由表3可知，所選自變量對(duì)中性蛋白酶水解度和硒溶出率影響較大，影響程度由大到小依次為料液比溫度加酶量，水解度模型擬合系數(shù)為0.9852，模型校正系數(shù)0.9663，硒溶出率模型擬合系數(shù)為0.9924，校正系數(shù)0.9826，說明水解度和硒溶出率模型分別有96.63%和98.26%的概率解釋自變量對(duì)因變量的變化規(guī)律。表2Box-Behnken響應(yīng)面優(yōu)化設(shè)計(jì)試驗(yàn)Table2Box-Behnkenresponse

20、surfaceoptimizationdesigntest由圖4-c、圖4-f可以看出，因素料液比和加酶量對(duì)水解度和硒溶出率具有交互作用，表3中料液比和加酶量交互作用F值分別為12.82和47.90，在統(tǒng)計(jì)學(xué)上具有極顯著性差異(P0.01)；RUAN等17研究認(rèn)為酶活性中心包埋在蛋白分子結(jié)構(gòu)中是影響蛋白水解的關(guān)鍵因素。表2中實(shí)驗(yàn)2、4、5和實(shí)驗(yàn)1016結(jié)果均表明，酶在反應(yīng)體系中的分散系數(shù)(酶添加量與體系溶劑體積比值)增大，水解度和硒溶出率呈現(xiàn)先升后降趨勢(shì)，說明酶在反應(yīng)體系中與底物的結(jié)合效率在某一分散系數(shù)下達(dá)到飽和，增加或降低酶分散系數(shù)，則會(huì)出現(xiàn)酶競爭性抑制15或酶與底物結(jié)合比例降低，從而影響水

21、解度和硒溶出率。同樣表現(xiàn)出具有交互作用的是圖4-d溫度和料液比對(duì)硒溶出率影響，表3中其交互影響F值7.23，達(dá)到顯著水平(P0.05)；其余因素交互影響均不顯著。經(jīng)過對(duì)響應(yīng)面3個(gè)因素分析得出最佳組合參數(shù)為酶解溫度53.03、料液比13.84、加酶量4885.33U/g，模型預(yù)測水解度達(dá)到33.12%，硒溶出率為83.34%。為方便實(shí)驗(yàn)操作，將參數(shù)調(diào)整為酶解溫度53、料液比13.8，加酶量4885U/g(為原料質(zhì)量的0.48%)，以驗(yàn)證模型準(zhǔn)確性；在該條件下，測定水解度值為(32.400.32)%，硒溶出率為(81.781.39)%，與預(yù)測值相比差異均不顯著(P0.05)，表明模型擬合較好，進(jìn)一

22、步驗(yàn)證模型準(zhǔn)確性。表3DH及SDR響應(yīng)面二次回歸模型及方差分析Table3DHandSDRresponsesurfacequadraticregressionmodelandanalysisofvariance注：*表示差異顯著(P0.05);*表示差異極顯著(P0.01);-表示差異不顯著(P0.05)ac-DH影響因素的交互作用;df-SDR影響因素的交互作用圖4水解度和硒溶出率因素交互作用等高線圖Fig.4ContourmapsoftheinteractionbetweentheDHandtheSDR2.4不同酶解時(shí)間對(duì)DH和SDR影響以響應(yīng)面模型優(yōu)化參數(shù)，進(jìn)一步探究不同酶解時(shí)間對(duì)水解度

23、及硒溶出率的影響，結(jié)果如圖5所示。從整體可以看出，硒溶出率與水解度呈現(xiàn)正相關(guān)，在一定酶解時(shí)間內(nèi)，硒溶出率隨水解度增大而增加。在酶解時(shí)間23h的過程中水解速率和硒溶出率均增長迅速，在這一過程中大量可溶性蛋白被釋放出來，增加了酶與底物蛋白的接觸面積從而使水解速率加快，已有研究表明18硒在生物體中多以蛋白肽形式存在，隨蛋白肽被釋放到酶解液中，硒溶出率也迅速增長；之后水解度呈現(xiàn)穩(wěn)步增長趨勢(shì)，硒溶出率在35h增長趨勢(shì)較為緩慢，5h后迅速增加到最大值，繼續(xù)酶解硒溶出率反而有所降低。通過實(shí)驗(yàn)觀察發(fā)現(xiàn)，酶解過程中酶解液逐漸澄清，可能存在不溶性肌基質(zhì)蛋白也逐步被分解，釋放出含硒肽，從而使硒溶出率增加；當(dāng)酶解時(shí)間

24、達(dá)到6h，硒溶出率達(dá)到最大97.02%，此時(shí)水解度達(dá)到46.95%，之后繼續(xù)酶解硒溶出率為95.05%略有降低，與酶解6h相比硒溶出率差異不顯著(P0.05)。圖5酶解時(shí)間對(duì)水解度和硒溶出率的影響Fig.5EffectsofenzymatichydrolysistimeonDHandSDR2.5不同酶解時(shí)間酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布及肽質(zhì)譜分析采用體積排阻色譜對(duì)不同時(shí)間酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量的分布進(jìn)行測定，結(jié)果見圖6-a，由圖6-a可以看出，華貴櫛孔扇貝未經(jīng)過酶解和酶解在之后分子質(zhì)量分布差異明顯；隨酶解時(shí)間延長酶解產(chǎn)物種類變化不明顯。對(duì)不同酶解時(shí)間產(chǎn)物分子質(zhì)量分布峰面積占比統(tǒng)計(jì)，結(jié)果見圖6-b，當(dāng)酶解時(shí)間

25、為0.5h，分子質(zhì)量大于5kDa的肽類減少，同時(shí)35kDa和13kDa的肽含量迅速增多，小于1kDa的肽在酶解1h后明顯增多；酶解時(shí)間2h后，4個(gè)組分增量變化平緩，其中13kDa肽含量分別占比58%、56%、56%，酶解6h小于1kDa肽占比11%，說明貝類酶解產(chǎn)物主要以小分子肽為主；何小慶等19波紋巴非蛤酶解液分子質(zhì)量小于3kDa占比55.12%。酶解產(chǎn)物中小于1kDa肽種類變化對(duì)產(chǎn)品風(fēng)味影響較大，因此選擇對(duì)2、4和6h酶解產(chǎn)物進(jìn)行01200m/z一級(jí)質(zhì)譜分析，結(jié)果如圖6-c所示，酶解2h酶解液中包含質(zhì)荷比122m/z1197m/z的小分子肽，平均肽鏈長度為3.99，與酶解4h和6h肽段區(qū)間

26、相似。從離子豐度可以看出，不同酶解時(shí)間節(jié)點(diǎn)質(zhì)荷比小于800m/z肽離子豐度相對(duì)質(zhì)荷比8001200m/z要高，鄔威等20研究中性蛋白酶酶解牛心肌分子質(zhì)量分布小于500Da占40%以上。當(dāng)酶解時(shí)間增加到4h，酶解液中肽的離子豐度也相應(yīng)增加，平均肽鏈長度為3.07，質(zhì)荷比266460m/z的小分子肽增多；當(dāng)酶解時(shí)間達(dá)到6h后，平均肽鏈長度降低為2.13，質(zhì)荷比274m/z的吸收峰豐度降低甚至消失，說明小分子肽也逐步被分解。質(zhì)譜結(jié)果表明，小分子肽種類隨酶解時(shí)間延長而增多，小分子肽的增多更有利于華貴櫛孔扇貝蛋白粉的開發(fā)；由圖6-b可以看出，6h后繼續(xù)酶解小于3kDa的小分子肽含量仍有增長趨勢(shì)，但有研究

27、表明21，酶解時(shí)間過長會(huì)使苦味肽含量增加，影響產(chǎn)品感官；因此控制酶解時(shí)間為6h，酶解產(chǎn)物小于3kDa肽的含量占67%，為高品質(zhì)蛋白粉的開發(fā)提供保障。2.6華貴櫛孔扇貝及酶解蛋白粉基本成分分析華貴櫛孔扇貝及蛋白粉基本成分如表4所示，華貴櫛孔扇貝蛋白含量為12.46g/100g(濕基)，經(jīng)過酶解得到蛋白粉蛋白含量達(dá)到82.58g/100g，水分含量較低，灰分和粗脂肪含量較酶解前均有所降低，總糖含量升高，得到的酶解蛋白粉具有高蛋白低脂的特點(diǎn)。2.7華貴櫛孔扇貝酶解蛋白粉營養(yǎng)評(píng)價(jià)華貴櫛孔扇貝酶解蛋白粉氨基酸含量測定結(jié)果如表5所示，華貴櫛孔扇貝酶解蛋白粉總氨基酸含量達(dá)到65.15g/100g，游離氨基酸

28、總量為8.12g/100g，肽基氨基酸含量為57.03g/100g，占氨基酸總量的87.54%，其中參與人腦組織化學(xué)合成主要氨基酸谷氨酸含量最高占10.5%，可促進(jìn)學(xué)齡兒童大腦發(fā)育。FAO/WHO推薦的理想蛋白模式認(rèn)為，質(zhì)量較好的蛋白質(zhì)其氨基酸組成EAA/TAA在40%左右，EAA/NEAA在0.6以上22；華貴櫛孔扇貝酶解蛋白粉必需氨基酸種類齊全，EAA/TAA為37.57%，EAA/NEAA為0.6019，符合這一模式。如表6所示，華貴櫛孔扇貝蛋白粉EAA為122.01%，遠(yuǎn)高于大黃魚魚卵蛋白粉(EAAI為51.9%)23，可見華貴櫛孔扇貝酶解蛋白粉氨基酸含量均高于比較蛋白氨基酸含量，且華

29、貴櫛孔扇貝酶解蛋白粉色氨酸含量較高，色氨酸參與IgG/IgM的合成，可增強(qiáng)人體免疫力22；同時(shí)蛋白粉中賴氨酸含量也較高為4.66%，其AAS為190.35，可很好與谷類等主食24(第一限制氨基酸為賴氨酸)形成互補(bǔ)，提高蛋白利用率。根據(jù)1973年FAO/WHO推薦的理想蛋白模式，華貴櫛孔扇貝酶解蛋白粉第一限制氨基酸為纈氨酸，AAS為69.72，氨基酸化學(xué)評(píng)分結(jié)果表明，華貴櫛孔扇貝酶解蛋白粉營養(yǎng)價(jià)值遠(yuǎn)超雞蛋；綜上可以說明華貴櫛孔扇貝酶解蛋白粉是一種優(yōu)質(zhì)蛋白，可用于營養(yǎng)保健品的研究與開發(fā)。a-不同時(shí)間酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布圖;b-不同時(shí)間各分子質(zhì)量組分占比;c-26h肽質(zhì)譜圖圖6華貴櫛孔扇貝酶解產(chǎn)物分子質(zhì)量分布及肽質(zhì)譜圖Fig.6MolecularweightdistributionandpeptidemassspectrometryoftheenzymatichydrolysateofChlamysnobilis表4華貴櫛孔扇貝及其酶解蛋白粉的基本成分單位：g/100gTable4GeneralbasiccompositionofChlamysnobilisanditsenzymaticallyhydrolyzedproteinpowder2.8華貴櫛孔扇貝酶解