實驗七微量淋巴細(xì)胞毒試驗

1、實驗七 細(xì)胞膜表面抗原檢測 補體依賴的微量淋巴細(xì)胞毒試驗 上海交大醫(yī)學(xué)院免疫教研室免疫學(xué)實驗上海交大醫(yī)學(xué)院免疫教研室抗體與淋巴細(xì)胞表面的膜抗原特異性結(jié)合后，免疫球蛋白的補體結(jié)合位點暴露。該抗原抗體復(fù)合物與補體結(jié)合而使其活化，通過一系列級聯(lián)反應(yīng)，形成攻膜復(fù)合物在細(xì)胞膜上穿孔，最終導(dǎo)致靶細(xì)胞的溶解死亡。在細(xì)胞被穿孔但尚未裂解前加入染料（如錐藍(lán)、伊紅等），可使染料進入細(xì)胞內(nèi)，而使細(xì)胞著色。同時這些細(xì)胞也表現(xiàn)出體積增大，折光性減弱、消失。相反，染料不能使活細(xì)胞染色，且活細(xì)胞折光性也可無改變。通過光學(xué)顯微鏡的觀察，可測得死細(xì)胞的百分率，以此來確定相應(yīng)靶細(xì)胞上是否攜帶有特異性的膜抗原。 原理：免疫學(xué)實驗上

2、海交大醫(yī)學(xué)院免疫教研室材料與試劑：器材（1）顯微鏡（2）細(xì)胞反應(yīng)板（2組合用）（3）一次性注射器4（2組合用）（4）試管、滴管（5）擦鏡紙、錐蘭瓶（4組合用）試劑（1）RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液100l（2組合用，請回收）（2）抗淋巴細(xì)胞血清100l（2組合用，請回收）（3）淋巴細(xì)胞懸液100l（2組合用，請回收）（4）補體（兔血清）200l（2組合用，請回收）（5）石蠟油8ml（6）細(xì)胞染色液（0.5%錐蘭生理鹽水溶液）1vial（4組合用）免疫學(xué)實驗step1上海交大醫(yī)學(xué)院免疫教研室操作步驟：按圖在反應(yīng)板上選好反應(yīng)孔與對照孔（甲組或乙組，每組3-5孔）。 在對照孔中各加入一滴培養(yǎng)液，反應(yīng)

3、孔中各加入一滴抗體。 混勻細(xì)胞懸液，在對照孔與反應(yīng)孔中各加入一滴細(xì)胞懸液，使其中液體混勻。室溫（222）作用30分鐘。 免疫學(xué)實驗甲組12345678910A對照孔B反應(yīng)孔CD對照孔E反應(yīng)孔F12345678910乙組上海交大醫(yī)學(xué)院免疫教研室 每孔加入補體3滴，室溫作用45分鐘。 step3step4每孔加入細(xì)胞染色液3滴，染色5分鐘。step2 吸去蓋板中的石蠟油與錐蘭溶液，鏡下觀察并判斷結(jié)果。 免疫學(xué)實驗上海交大醫(yī)學(xué)院免疫教研室實驗結(jié)果記錄與分析 ：免疫學(xué)實驗按下表，記錄各孔死細(xì)胞百分率。反應(yīng)孔1 2345對照孔1 2345死細(xì)胞數(shù)（%）死細(xì)胞數(shù)（%）記分記分上海交大醫(yī)學(xué)院免疫教研室實驗結(jié)

4、果記錄與分析 ：免疫學(xué)實驗判斷待檢標(biāo)本是否陽性：對照CDC統(tǒng)一記分法，判斷實驗結(jié)果。死細(xì)胞百分?jǐn)?shù)記分意義0-101陰性（）11-202可疑陽性（）21-404弱陽性（+）41-806陽性（+）81-1008強陽性（+）0無效（O）上海交大醫(yī)學(xué)院免疫教研室注意事項： 補體：補體質(zhì)量是影響實驗結(jié)果的關(guān)鍵因素之一，一般采用新鮮的兔血清。每批補體使用前須測定是否存在天然細(xì)胞毒作用，應(yīng)選用無細(xì)胞毒作用者。同時應(yīng)測定補體的效價。 靶細(xì)胞：根據(jù)實驗?zāi)康牡倪x用相應(yīng)的靶細(xì)胞。要求所選用的細(xì)胞活力好，死細(xì)胞數(shù)不大于10%，細(xì)胞純度高，盡可能少含非靶細(xì)胞，細(xì)胞濃度合適，以1.5-2.0106/ml為宜。 反應(yīng)條件： 時間：時間過長、過短都可能造成假陰性或假陽性。 溫度：溫度不宜過高或過低，兩者均會影響實驗結(jié)果。 加樣時要注意將針尖伸入石蠟油內(nèi)，但不直接碰到孔底，此即所謂“軟加”。這樣可避免試劑浮于油層表面，或使針尖沾上已加的