邪毒壅盛證H22荷瘤小鼠腫瘤組織基因的表達特征研究

1、邪毒壅盛證H22荷瘤小鼠腫瘤組織基因的表達特征研究卓少元方肇勤盧文麗潘志強梁超吳中華劉小美侯俐張輝廖明娟高必峰【摘要】目的提醒H22荷瘤小鼠邪毒壅盛證腫瘤組織基因表達的特征。方法采用GenehipuseExn1.0STArray等技術及芯片分析方法，觀察H22荷瘤小鼠邪毒壅盛、早期氣虛、中期陽氣虛及中晚期氣陰陽虛證腫瘤組織基因表達的差異。結果挑選到邪毒壅盛證獨特性高表達的基因32個，其中包括Tte3、Phf7、Ldh等參與睪丸發(fā)育、精子或卵子發(fā)生的基因22個，Adipq、Nra、Tnfaip6等與腫瘤有關的基因4個，以及Atp8b3、Pnpla3、Retn等其他功能的基因6個。挑選到邪毒壅盛證

2、獨特性低表達的基因2個，有rt和L668417。結論邪毒壅盛證H22荷瘤小鼠腫瘤組織中存在大量獨特性表達的基因，可能是該證候與其他證候區(qū)別的內(nèi)在特征?！娟P鍵詞】腫瘤；證候；同病異證；邪毒壅盛證；基因芯片；小鼠Abstrat：bjetiveTinvestigategenesexpressinprfileinturtissuesfH22ieithbstrutinfevilsyndres.ethdsGenesexpressinintheturtissuesfH22ieithsyndresfbstrutinfevilsyndres,“Qidefiieny,defiienyf“QiandYang,rde

3、fiienyf“QiYinandYang,ereanalyzedbyAffyetrixGenehipuseExn1.0STArray.Results32speialhigher-expressingeneserebserved,inluding22geneshihinvlveintestilegrth,speratgenesisrgenesis,4genesrelatedtturs,and6thergene.Siultaneusly,2speialler-expressingeneserebserved.nlusinNuerusgeneshavespeialexpressinintheturt

4、issuefH22ieithbstrutinfevilsyndres,hihaybeintrinsidifferenebeteenthissyndreand3thersyndres.Keyrds：Tur;Syndre;DifferentSyndrefrthesaedisease;bstrutinfEvilSyndres;Genehip;ie“同病異證和“同病異治是中醫(yī)理論的特色之一，其內(nèi)在物質(zhì)根底是什么，是長期以來被關注和研究的課題。本工程組以往的研究建立起H22荷瘤小鼠常見證候的標準化檢測與辨證14，發(fā)現(xiàn)隨著腫瘤的開展，荷瘤小鼠會自發(fā)形成證候并發(fā)生演變，早期以邪毒壅盛證和氣虛證為主，以后開展

5、為陽氣虛證和氣陰陽虛證，與人類非常相似5，6。為提醒“同病異證物質(zhì)根底，我們采用Affyetrix的GenehipuseExn1.0STArray技術，對H22荷瘤小鼠邪毒壅盛證、氣虛證、陽氣虛證和氣陰陽虛證4個常見證候的腫瘤、下丘腦、垂體、腎上腺等組織基因的表達進展了檢測。本文重點討論邪毒壅盛證H22荷瘤小鼠腫瘤組織基因表達的特征?，F(xiàn)報道如下。1材料與方法1.1芯片檢測數(shù)據(jù)的獲取采用工程組最近研究獲得的4種常見證候荷瘤小鼠腫瘤組織的外顯子芯片數(shù)據(jù)：昆明種小鼠購自上海中醫(yī)藥大學動物實驗中心，雄性，體重24g26g，合格證號SXK滬2022-0003，清潔級，腋下接種H22腫瘤腹水癌細胞后，采用

6、小鼠計量化四診和辨證方法1，挑選出最典型的早期接種后8d邪毒壅盛證和氣虛證，中期接種后21d陽氣虛證和中晚期接種后29d氣陰陽虛證荷瘤小鼠各16只，并分別提取4個不同證候小鼠腫瘤組織RNA，將各證候16個樣本合并，采用AffyetrixGenehipuseExn1.0STArray及其方法進展檢測。外顯子芯片的檢測結果有兩種輸出方式：外顯子和核心基因。本文取16661個核心基因進展初步分析7。1.2芯片數(shù)據(jù)的處理1.2.1相關基因的挑選條件四張芯片中讀數(shù)至少有一組芯片統(tǒng)計讀數(shù)以下簡稱讀數(shù)大于270的基因該芯片讀數(shù)均數(shù)，以排除那些表達過低者；邪毒壅盛芯片讀數(shù)與單純氣虛、陽氣虛、氣陰陽虛等3組比值

7、，大于2.0或小于0.5的基因視為上、下調(diào)的基因。1.2.2相關基因信息的挖掘利用互聯(lián)網(wǎng)上最具代表性、權威性的生物醫(yī)學文獻數(shù)據(jù)庫NBI和清華同方全文數(shù)據(jù)庫NKI等，對符合挑選條件的相關基因進展文獻信息挖掘和分析。2結果在芯片的16661個基因中，至少有一組讀數(shù)大于270的基因有6342個。其中，邪毒組與氣虛、陽虛、陰虛3組相比，比值均大于2.0的基因有Tte3、Vd2、ael、Atp8b3、Tuba3和Gst5等32個，而比值均小于0.5的有rtistatin和L668417等2個基因。根據(jù)其參與的生物學功能大體上可以分為以下幾類。2.1邪毒壅盛證腫瘤組織獨特高表達的基因2.1.1參與睪丸發(fā)育

8、、精子發(fā)生和成熟或卵子發(fā)生的基因有Tte3，Phf7，Ldh，Vd2，ael，F(xiàn)hl4，Tuba3等22個基因，這類基因在早期邪毒壅盛H22荷瘤小鼠腫瘤組織中的表達量都非常高，甚至個別基因芯片讀數(shù)大于500見表1；在正常小鼠中，這類基因大多數(shù)在睪丸組織特異表達，還有少數(shù)基因雖在其它組織中也有表達，但以睪丸組織表達程度最高。如Tte3，即T復合體相關睪丸表達3t-plex-assiatedtestisexpressed3基因，它來源于小鼠T復合體區(qū)域、并在小鼠睪丸生殖細胞中特異性表達8，在小鼠睪丸中通過與活性很高的酪氨酸激酶2asEinkinase2，K2的調(diào)節(jié)亞基特異性識別，參與細胞的轉化和增

9、殖9；而在很多組織中都有表達Phf7PHDfingerprtein7，在人類和小鼠睪丸組織僅在支持細胞中表達表達程度很高，主要參與精子發(fā)生的轉錄調(diào)節(jié)10；Ldh基因編碼蛋白乳酸脫氫酶4latatedehydrgenase-4，LDH-4是一種僅在哺乳動物睪丸中表達的代謝酶，基因核心啟動子含有的G盒-70-65和REAP應答元件，-53-49，-39-35是其在睪丸中完全表達所必需的順式作用元件11。表1邪毒壅盛證腫瘤組織獨特性高表達的參與睪丸發(fā)育、精子發(fā)生等有關基因略*局部功能給予詳細介紹的重要基因2.1.2與腫瘤有關的基因包括Adipq、Nra、Tnfaip6和Pld4等4個基因見表2。這類

10、基因的表達產(chǎn)物是細胞因子、黏附分子或酶類，不僅具有正常的生理功能，還與腫瘤有比擬親密的關系。如脂聯(lián)素Adipq是脂肪細胞分泌的一種脂肪細胞因子，具有增加胰島素敏感性、抗動脈粥樣硬化、抑制炎癥反響等作用，低脂聯(lián)素程度可獨立增加患子宮內(nèi)膜癌、乳腺癌、胃癌和前列腺癌等的危險性，脂聯(lián)素可能具有抗腫瘤活性12；Nra，即神經(jīng)原相關細胞粘附分子neurn-glia-A-relatedelladhesinleule，在人黑色素瘤和結腸癌細胞和組織中，是-atenin/LEF-1信號途徑的一個靶基因，其表達能促進細胞的遷移和腫瘤的發(fā)生13可能是通過金屬蛋白酶etallprtease介導的NRA脫落的胞外區(qū)來實

11、現(xiàn)的14；而腫瘤壞死因子誘導蛋白6Tnfaip6，turnersisfatralphainduedprtein6，又名TSG6，在炎癥損傷和卵巢排卵過程中表達上調(diào)，表現(xiàn)出抗炎活性、并在雌性生殖中起關鍵作用15，可作為前列腺癌或癌前期損傷診斷和預后的一個潛在靶標16；Pld4磷脂酶4是G1/S期表達的早期基因之一，可能在細胞生長中起重要作用，Pld4RNA在再生肝中的表達明顯高于正常肝臟，并廣泛分布于腫瘤細胞如肝細胞瘤hepata和sr轉染的細胞中17。2.1.3其他功能的基因有6個，即Atp8b3，Pnpla3，Retn，L380907，Efhd1和Phyhipl。見表3。表2邪毒壅盛證腫瘤組

12、織獨特性高表達的與腫瘤有關的基因略*局部功能給予詳細介紹的重要基因2.2邪毒壅盛證腫瘤組織獨特性低表達的基因這類基因很少，僅有rt和L668417兩個見表4。其中，rt的基因產(chǎn)物皮質(zhì)抑素rtistatin，RT或ST，是一種在構造上與生長抑素satstatin，SRIF非常相似的神經(jīng)肽，可與所有的生長抑素受體結合，表現(xiàn)出神經(jīng)元活性受抑等與SRIF共同的特性。但是，它也有許多與生長抑素不同的特性，例如與大腦皮層中乙酰膽堿的興奮作用相拮抗誘導慢波睡眠、自發(fā)活動減少，以及對生長抑素沒有反響的陽離子選擇性電流的激活等。此外，RT存在于人類內(nèi)分泌胰腺，可能參與胰島素和/或胰高血糖素程度的調(diào)節(jié)18。表3邪

13、毒壅盛證腫瘤組織獨特性高表達的其他類基因略表4邪毒壅盛證腫瘤組織獨特性低表達的基因略*局部功能給予詳細介紹的重要基因3討論證候的形成有著復雜的物質(zhì)根底，為此，采用基因芯片這樣高效、大通量的檢測手段非常必要。為了防止荷瘤小鼠個體的差異，我們采用了標準化的小鼠四診檢測與計量化的辨證方法，并將同一證候最典型的16只小鼠腫瘤RNA樣本合并，使芯片檢測數(shù)據(jù)可以較客觀地反映出各證候的集中趨勢。GenehipuseExn1.0STArray含有16661個基因，面對如此多的基因，如何挑選那些可能具有重要病理意義的基因呢？基于功能重要的基因往往表達量大的生物學特點，我們?nèi)∷行酒x數(shù)均數(shù)270作為入選標準，在

14、4個組別中一致小于該均數(shù)者放棄，希望能首先關注那些表達量較大者。邪毒壅盛是H22荷瘤小鼠早期一個常見的證候，突出表如今腫瘤增長迅速、小鼠死亡率高、預后差，與同期的氣虛證有很大的區(qū)別，是典型的同病異證6，7。是哪些基因表達的改變導致了這種證候的發(fā)生，并使得腫瘤增長如此迅速？通過對4張不同證候腫瘤芯片讀數(shù)的分析，我們看到，與其他3種證候相比，在邪毒壅盛證荷瘤小鼠腫瘤組織獨特性表達的34個基因中，有32個基因表達升高，其中竟有22個以往的研究發(fā)現(xiàn)與睪丸發(fā)育、精子發(fā)生和成熟或卵子發(fā)生等有關，這些基因不僅數(shù)目眾多，而且表達量大。邪毒壅盛證H22荷瘤小鼠腫瘤組織有如此多的參與發(fā)育生殖的基因，這還是首次被觀

15、察到。通過文獻檢索我們還發(fā)現(xiàn)高表達基因中包括有細胞因子或粘附分子類基因，或多或少與各種腫瘤有著親密的關系，具有共性。這些基因在邪毒壅盛證小鼠腫瘤表達獨特，很可能是該證候小鼠腫瘤快速增長、并導致該證候與其他證候差異的關鍵物質(zhì)根底之一。該結果還提示，不管是邪毒壅盛證，還是其他證候，確實存在著獨特性表達的基因，有規(guī)律可循，并可能是中醫(yī)證候理論復雜內(nèi)涵的一角。因此，本研究為進一步認識“同病異證的物質(zhì)根底以及我們今后深化的研究奠定了基?！緟⒖嘉墨I】1方肇勤.辨證論治實驗方法學實驗小鼠診法和辨證,第1版.上海：上?？茖W技術出版社,2022:132.2方肇勤,潘志強,付曉伶,等.小鼠四診采集工程標準的建議J

16、.中國中醫(yī)根底醫(yī)學雜志,2022,11(9):692.3方肇勤,潘志強,湯偉昌,等.小鼠四診工作站構建與操作標準討論J.上海中醫(yī)藥大學學報,2022,20(1):42.4方肇勤,潘志強,盧文麗,等.小鼠常見證候的辨證標準J.中國中醫(yī)根底醫(yī)學雜志,2022,12(7):508.5方肇勤,潘志強,陳曉.實驗小鼠四診方法學的創(chuàng)立和意義J.上海中醫(yī)藥大學雜志,2022,40(7):1,封3.6方肇勤,侯俐,盧文麗,等.荷瘤小鼠證候的發(fā)生、演變、兼證及預后J.上海中醫(yī)藥雜志,2022,41(1):57.7方肇勤,盧文麗,潘志強,等.不同證候荷瘤小鼠神經(jīng)-內(nèi)分泌-免疫網(wǎng)絡基因轉錄的特征J.中華中醫(yī)藥雜志,

17、2022，(增刊):8.8RappldGA,TrsdaleJ,LihterP.Assignentfthehuanhlgueftheuset-plexgeneTTE3thuanhrse6q27J.Genis.1992Aug;13(4):1337.9BaiX,hanED,XuX.TheprtEinfanegene,Ttex4,interatsithprteinkinaseK2betasubunitandishighlyexpressedinusetestisJ.BiheBiphysResun，2022Jul18;307(1):86.10XiaJ,Xu,LiJ,etal.NYD-SP6,anvelg

18、eneptentiallyinvlvedinregulatingtestiulardevelpent/speratgenesisJ.BiheBiphysResun，2002，291(1):101.11TangH,KungA,GldbergE.Regulatinfurinelatatedehydrgenase(Ldh)geneexpressinJ.BilReprd.2022ar;78(3):455.12陳仲.脂聯(lián)素蛋白的純化方法及卵巢癌ES-2體外抑瘤活性研究D.中國協(xié)和醫(yī)科大學碩士學位論文.2022：7.13nai-SrrellE,Ben-YedidiaT,Shtutan,etal.Nr-Aisatargetgenefthebeta-atenin/LEF-1pathayinelanaandlnaneranditsexpressinenhanestilityandnfersturigenesisJ.GenesDev.2002Aug15;16(16):2058.14nai-Srrell,KaplanA,RavehS,etal.TheshedetdainfNr-Astiulat