耐氨芐西林流感嗜血桿菌產(chǎn)β內酰胺酶機制研究

1、耐氨芐西林流感嗜血桿菌產(chǎn)-內酰胺酶機制研究摘要目的：探究耐氨芐西林的流感嗜血桿菌產(chǎn)生-內酰胺酶的機制。要領：對臨床分散的112株流感嗜血桿菌耐藥菌用紙片法作-內酰胺酶測定，用PR法檢測產(chǎn)酶流感嗜血桿菌中的-內酰胺酶基因的存在。效果：紙片法測得產(chǎn)酶菌株32株，產(chǎn)酶率28.6(32/112)；32株產(chǎn)酶菌中PR法測-內酰胺酶基因陽性菌株29株，陽性率為90.6%(29/32)，此中質粒DNA模板組陽性為25株，基因組DNA模板組陽性為4例。結論：(1)流感嗜血桿菌耐氨芐西林重要由質粒介導產(chǎn)生-內酰胺酶所造成。(2)PR法是研究流感嗜血桿菌是否攜帶-內酰胺酶基因及該基因地點位置的輕便而有效的要領。自

2、1972年第一次創(chuàng)造流感嗜血桿菌因產(chǎn)-內酰胺酶而致耐氨芐西林以來1，外洋對耐氨芐西林流感嗜血桿菌的耐藥機制以及產(chǎn)-內酰胺酶的分子底子研究,呈逐年增長趨勢。1978年Bryan等2初次報道了質粒介導產(chǎn)生-內酰胺酶的流感嗜血桿菌。今后，圍繞流感嗜血桿菌中的質粒編碼-內酰胺酶及其與耐氨芐西林的干系舉行了很多研究。我國由于流感嗜血桿菌的分散率較低，對此題目的研究不停沒有深化。本文作者在本實行室樂成進步流感嗜血桿菌分散率的底子上3,4，分散得到36株耐氨芐西林的流感嗜血桿菌，用紙片法測定它們產(chǎn)-內酰胺酶的環(huán)境后，用PR要領對產(chǎn)酶菌中-內酰胺酶基因的存在與否舉行了檢測，對耐氨芐西林的流感嗜血桿菌產(chǎn)生-內酰

3、胺酶機制作了開端闡發(fā)。1質料和要領1.1流感嗜血桿菌的分散造就網(wǎng)絡痰或咽拭子標本，于1h內接種于改進的哥倫比亞巧克力瓊脂平板中，置5%2孵箱，37孵育1824h,對疑似流感嗜血桿菌的菌落別離于血瓊脂和營養(yǎng)瓊脂平板上作衛(wèi)星試驗，僅在血瓊脂平板上衛(wèi)星試驗陽性者為流感嗜血桿菌。用通例的紙片法K-B法對每個菌株作體外藥物敏感試驗，按照美國NLS尺度判讀藥敏效果。從平板上挑取耐氨芐西林的單菌落接種于含3l液體HT造就液的試管中，于5%2孵箱37孵育造就留宿，離心網(wǎng)絡菌體用于質粒制備等后續(xù)實行。1.2紙片法測定-內酰胺酶將流感嗜血桿菌造就物經(jīng)超聲裂解后直接涂布于-內酰胺酶紙片上，在15in內變紅者為陽性。

4、超聲儀為BransnSnifier250，-內酰胺酶紙片購自xid公司。1.3PR法檢測-內酰胺酶基因2效果2.1流感嗜血桿菌的分散自1997年10月至1998年11月,從我院呼吸內科及耳鼻咽喉科呼吸道熏染患者中網(wǎng)絡634份痰及咽拭子標本，分散斷定出112株流感嗜血桿菌,此中，藥敏試驗證實為氨芐西林耐藥的36株。2.2-內酰胺酶檢測效果36株耐氨芐西林流感嗜血桿菌中，紙片法測得產(chǎn)酶菌株32株，耐藥菌中產(chǎn)酶率88.9%(32/36)。2.3PR法檢測-內酰胺酶基因效果用針對-內酰胺酶基因的上游和卑劣特異性引物擴增后，陽性條帶巨細為486bp，擴增效果與預期值雷同。32株產(chǎn)酶菌中PR陽性菌株29株

5、，陽性率為90.6%。此中以質粒為模板PR陽性菌株25株，占產(chǎn)酶菌的78.1%25/32)；對7株質粒DNA模板PR陰性的菌株，以基因組DNA為模板舉行PR擴增，效果有4株為陽性。3討論外洋對耐氨芐西林流感嗜血桿菌產(chǎn)-內酰胺酶的分子機制研究，重要接納的要領是在大量造就細菌的底子上，通過sl密度梯度超離心等要領獵取較大量的質粒DNA，舉行限定性內切酶酶切闡發(fā)、瓊脂糖凝膠電泳、質粒轉化試驗等，大抵闡發(fā)質粒DNA的大孝布局，驗證質粒介導的耐氨芐西林表型等，得到質粒介導的產(chǎn)酶及其與耐氨芐西林藥物的干系等的可靠證據(jù)6。但是，天然狀態(tài)的流感嗜血桿菌菌株中所攜帶的野生型質粒的大孝布局、拷貝數(shù)差異非常大，對細

6、菌造就的數(shù)目、質粒抽提純化的要領提出了很高的要求，其布局的變異也造成電泳、酶切闡發(fā)等要領難以做到準確闡發(fā)質粒的布局。別的，野生型質粒的分子量通常較大，常用的轉化實行樂成率不高；再加上野生型菌株中所含質粒布局龐大，而這些要領都未能直接斷定質粒DNA中是否攜帶有編碼-內酰胺酶的基因。鑒于上述環(huán)境，本實行方案了針對-內酰胺酶基因的特異性引物，對所分散得到的產(chǎn)-內酰胺酶的耐氨芐西林流感嗜血桿菌中該酶編碼基因的存在環(huán)境舉行了直接的PR檢測。效果創(chuàng)造，32株產(chǎn)-內酰胺酶的流感嗜血桿菌，用可靠的堿變性法獵取的質粒DNA為模板舉行PR檢測，陽性率到達78.1%，而7株質粒DNA模板PR陰性的產(chǎn)酶菌株中，有4株

7、在以染色體DNA樣品為模板舉行的PR反響中表示陽性。這些效果提示耐氨芐西林的流感嗜血桿菌編碼-內酰胺酶的基因重要存在于所攜帶的質粒DNA上，而有少部門酶基因位于染色體DNA上，這與文獻報道的結論同等。從要領上看，本研究所接納的PR法直接檢測耐氨芐西林流感嗜血桿菌中-內酰胺酶基因的要領，特異性高，標本產(chǎn)-內酰胺酶的核苷酸序列具有高度的特異性；敏感性高，PR要領可將待測DNA片斷的量擴大百萬倍，可以檢測細菌含量極微的標本；既可以測質粒模板-內酰胺酶基因，也可以測染色體模板-內酰胺酶基因；假設共同PR產(chǎn)物的序列測定等，還可用于-內酰胺酶分類、基因序列闡發(fā)、分子盛行病學觀察等。但PR要擁有假陽性的環(huán)境

8、，如-內酰胺酶基因布局出現(xiàn)變異但未影響PR引物結合位點時，大概存在PR陽性但基因并無活性的環(huán)境。從理論上講，能產(chǎn)生-內酰胺酶的菌株均應有相應的編碼基因存在，但本實行中有3株PR陰性，大概的緣故原由是模板制備歷程以及PR反響歷程所造成的假陰性所致。固然外洋有效PR要領檢測流感嗜血桿菌菌株、-內酰胺酶基因及其分類的報道7，海內袁藝等8曾用PR法檢測流感嗜血桿菌菌株，但對產(chǎn)-內酰胺酶的耐氨芐西林流感嗜血桿菌，別離以其質粒DNA和染色體DNA為模板，用PR要領測-內酰胺酶基因，研究其產(chǎn)酶和耐藥機制的，國表里均未見報道。參考文獻1GunnBA,dallJB,JnesJF,etal.Apiillin-re

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