環(huán)境微生物學-實驗四(五) 細菌的純培養(yǎng)、分離

1、- -實驗四（五）環(huán)境中微生物分離與培養(yǎng)一、實驗目的1、掌握從環(huán)境（土壤、水體、活性污泥、垃圾堆肥等）中分離培養(yǎng)細菌的方法，獲得若干種細菌純種培養(yǎng)技能。2、掌握幾種接種技術(shù)。3、了解菌種的保藏方法。二、實驗儀器和材料恒溫箱、涂布器、細鐵絲、接種環(huán)、酒精燈、吸耳球、棉花、記號筆；無菌培養(yǎng)皿（直徑90毫米）、無菌移液管（1毫升和10毫升）；肉湯蛋白胨培養(yǎng)基、高氏1號培養(yǎng)基、馬鈴薯培養(yǎng)基；活性污泥或土壤10克、無菌水90毫升、9毫升無菌水（試管中）；酵母、大腸桿菌。三、細菌純種分離的操作方法細菌純種分離的方法有兩種：稀釋平板法和平板劃線法。（一）稀釋平板分離的方法1、取樣用無菌錐形瓶到現(xiàn)場取一定數(shù)量

2、的活性污泥或土壤，迅速帶回實驗室。2、稀釋水樣將1瓶90毫升和5管9毫升的無菌水排列好，按10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6依次編號。在無菌操作條件下，將樣品（10克）置于第一瓶90毫升無菌水中，用手搖10分鐘，將顆粒狀樣品打散，即為10-1濃度的菌液。用1毫升無菌移液管吸取1毫升10-1濃度的菌液于一管9毫微升無菌水中，同樣方法，依次稀釋到10-6。每次稀釋時，需用不同的無菌移液管，或?qū)⑼灰埔汗苡脽o菌水洗三次。3、平板的制作取10套無菌培養(yǎng)皿編號，10-4、10-5、10-6各3個，另1個為空氣對照。取1支1毫升無菌移液管從濃度小的10-6菌液開始，以10-6、10

3、-5、10-4為序分別吸取0.5毫升菌液于相應編號的培養(yǎng)皿內(nèi)（注：每次吸取前，用移液管在菌液中吹泡使菌液充分混勻），加熱熔化培養(yǎng)基，當培養(yǎng)基冷至45C左右時，右手拿裝有培養(yǎng)基的錐形瓶，左手拿培養(yǎng)皿，以中指、無名指和小指托住皿底，拇指和食指夾住皿蓋，靠近火焰，將皿蓋掀開，倒入培養(yǎng)基后將培養(yǎng)皿平放在桌上，順時針和逆時針來回轉(zhuǎn)動培養(yǎng)皿，使培養(yǎng)基和菌液充分混勻，冷凝后即成平板，倒置于30C恒溫箱中培養(yǎng)48小時，然后觀察結(jié)果。取對照無菌培養(yǎng)皿，打開皿蓋10分鐘后蓋上皿蓋，倒置30C恒溫箱中培養(yǎng)48小時后，觀察結(jié)果。（二）平板劃線分離法1、平板的制作將融化并冷至50C的瓊脂培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，使凝固成

4、平板。2、操作用接種環(huán)挑取一環(huán)活性污泥（或土壤懸液等），左手拿培養(yǎng)皿，中指、無名指和小指托住皿底，拇指和食指夾住皿蓋，將培養(yǎng)皿稍傾斜，左手拇指和食指將皿蓋掀半開，右手將接種環(huán)伸入培養(yǎng)皿內(nèi)，在平板上輕輕劃線（切勿劃破培養(yǎng)基），劃線的方式可取交叉法和平行法。劃線完畢后，蓋好皿蓋，倒置30C恒溫箱中培養(yǎng)48小時后，觀察結(jié)果。四、幾種接種技術(shù)操作由于實驗的目的、所研究的微生物種類、所用的培養(yǎng)基及容器的不同，接種方法也有多種，現(xiàn)簡介如下：1、接種用具常用的接種用具有接種環(huán)、接種針、接種鉤、接種鏟、移液管、滴管等。接種環(huán)和接種針總長約25厘米，環(huán)、針、鉤的長為4.5厘米，可用白金或鎳絲制成。上述材料以白金

5、絲最為理想，其優(yōu)點是：在火焰灼燒后冷卻快，不易氧化且無毒。但價格昂貴，一般用鎳絲。接種環(huán)的柄為金屬的，其后端套上絕熱材料套，柄也可用玻璃棒制作。2、接種環(huán)境微生物的分離培養(yǎng)、接種等操作需在經(jīng)紫外線滅菌的無菌操作室、無菌操作箱、生物超凈工作臺等條件下進行。教學實驗由于人多，無菌室小，無法一次容納所有實驗者，所以，在一般實驗室內(nèi)進行，這時要特別注意無菌操作，也可分組分批進行。3、幾種接種技術(shù)1）斜面接種技術(shù)這是將長在斜面培養(yǎng)基（或平板培養(yǎng)基）上的微生物接到另一支斜面培養(yǎng)基上的方法。接種前將桌面擦凈，將所需的物品整齊有序地放在桌子上；將試管貼上標簽，注明菌名、接種日期、接種人、組別、姓名等；點燃酒精

6、燈。將一支斜面菌種和一支待接的斜面培養(yǎng)基放在左手上，拇指壓住兩支試管，中指位于兩支試管之間，斜面向上，管口齊平，右手先將棉塞擰松動，以便接種時拔出。右手拿接種環(huán)，在火焰上將接種環(huán)燒紅（環(huán)以上凡是可能進入試管的部分都應灼燒）。在火焰旁，用右手小指、和無名指和手掌夾住棉塞將它拔出。試管口在火焰微燒一周，將管口上可能沾染的少量菌或帶菌塵埃被燒掉。將燒過的接種環(huán)伸入菌種管內(nèi)，先觸及沒長菌的培養(yǎng)基使環(huán)冷卻，然后輕輕挑取少許菌種，將接種環(huán)抽出管外迅速伸入另一試管底部，在斜面上由底部向上劃曲線。抽出接種環(huán)，將試管塞上棉塞并插在試管架上，最后再次燒紅接種環(huán)，則接種完畢。2）液體培養(yǎng)基中的菌種被接入液體培養(yǎng)基接

7、種用具是無菌移液管和無菌滴管，移液管和滴管是玻璃制成的，不能在火焰上燒，以免碰到水時玻璃破裂，需預先滅菌。用無菌移液管自菌種管中吸取一定量的菌液接到另一管液體培養(yǎng)基中，將試管塞好棉塞即可。3）液體接種這是由斜面培養(yǎng)基接種到液體培養(yǎng)基中的方法。用接種環(huán)挑取一環(huán)斜面培養(yǎng)基上的菌種送入液體培養(yǎng)基中，使環(huán)在液體表面與管壁處輕輕研磨，將環(huán)上的菌種全部洗入液體培養(yǎng)基中，取出接種環(huán)，塞上棉塞。將試管輕輕撞擊手掌使菌體在液體培養(yǎng)基中均勻分布。最后將接種環(huán)燒紅。4）穿刺接種這是將斜面菌接種到固體或半固體深層培養(yǎng)基的方法。如斜面接種操作，用接種針（必須很挺直）挑取少量菌種，將帶菌種的接種針刺入半固體深層培養(yǎng)基中直

8、到接近管底，然后沿穿刺線緩慢地抽出，塞上棉塞，燒紅接種針，則接種完畢。5）稀釋平板涂布法稀釋平板涂布法與稀釋平板法、平板劃線法的作用一樣，都是把聚集在一起的群體分散成能在培養(yǎng)基上長成單個菌落的分離方法。此法接種量不宜太多，只能在1毫升以下，培養(yǎng)時起初不能倒置，先正擺一段時間等到水分蒸發(fā)后倒置。此法步驟如下：稀釋樣品方法與稀釋平板法中的稀釋方法和步驟一樣。倒平板將融化的并冷至50C左右的培養(yǎng)基倒入無菌培養(yǎng)皿中，冷凝后即成平板。用無菌移液管吸取一定量的經(jīng)適當稀釋的樣品液于平板上，換上無菌涂布器在平板上旋轉(zhuǎn)涂布均勻。正擺在所需溫度的恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)，如果培養(yǎng)時間較長，次日把培養(yǎng)皿倒置繼續(xù)培養(yǎng)。待長出菌落

9、觀察結(jié)果。五、實驗內(nèi)容和步驟1、用平板涂布法從土壤中分離菌種取樣稀釋水樣平板的制作培養(yǎng)觀察記數(shù)2、平板劃線分離法制作平板平板劃線3、斜面接種接種前將桌面擦凈，將所需的物品整齊有序地放在桌子上；將試管貼上標簽，注明菌名、接種日期、接種人組別、姓名等；點燃酒精燈；接種；培養(yǎng)；后觀察。六、菌種的保藏（一）基本原理微生物具有容易變異的特性。因此，在保藏過程中，必須使微生物的代謝處于最不活躍或相對靜止的狀態(tài)，才能在一定的時間內(nèi)，使其不發(fā)生變異而又保持生活能力。低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，微生物的保藏方法也是依據(jù)它們而設計的。（二）保藏方法保藏方法大致可分為以下幾種：1、傳代培養(yǎng)

10、保藏法傳代培養(yǎng)保藏法又有斜面培養(yǎng)、穿刺培養(yǎng)、庖肉培養(yǎng)基培養(yǎng)等（后者作保藏厭氧細菌用）。將菌種接種到適宜的固體斜面培養(yǎng)基上，待菌充分生長后，棉塞部分用油紙包好，培養(yǎng)后于46C冰箱內(nèi)保存。保藏時間依微生物的種類而不同，霉菌、放線菌及有芽孢的細菌可保存24個月，再移種一次。酵母菌兩個月，細菌最好每月移種一次。此法為實驗室和工廠菌種室常用的保藏法，其優(yōu)點是操作簡單，使用方便，不需特殊設備，能隨時檢查所保藏的菌種是否死亡、變異與污染雜菌等。缺點是容易變異，因為培養(yǎng)基的物理、化學性質(zhì)不是嚴格恒定的。多次傳代會使微生物是代謝改變，而影響微生物的性狀；污染雜菌的機會也較多。2、液體石蠟覆蓋保藏法是傳代培養(yǎng)的變

11、相方法，能夠適當延長保藏時間，它是在斜面培養(yǎng)物和穿刺培養(yǎng)物上面覆蓋滅菌的液體石蠟，一方面可防止因培養(yǎng)基水分蒸發(fā)而引起菌種死亡，另一方面可阻止氧氣進入，從而減弱代謝作用。此法實用而且效果好。霉菌、放線菌、芽孢細菌可保藏2年以上不死，酵母菌可保藏12年，一般無芽孢的細菌也可保藏1年。此法的優(yōu)點是制作簡單，不需特殊設備，且不需經(jīng)常移種。缺點是保存時必須直立放置，所占位置較大，同時也不便攜帶。從液體石蠟下面取培養(yǎng)物移種后，接種環(huán)在火焰上燒灼時，培養(yǎng)物容易與殘留的液體石蠟一起飛濺，應特別注意。3、載體保藏法是將微生物吸附在適當?shù)妮d體。如土壤、沙子、硅膠、濾紙上，而后進行干燥的保藏法，例如沙土保藏法和濾紙

12、保藏法應用相當廣泛。濾紙保藏法較液氮、冷凍干燥法簡便，不需要特殊設備。沙土保藏法多用于產(chǎn)生孢子的微生物，但應用于營養(yǎng)細胞效果不佳。4、寄主保藏法此法用于目前尚不能在人工培養(yǎng)基上生長的微生物，如病毒、立克次氏體、螺旋體等，它們必須在生活的動物、昆蟲、雞胚內(nèi)感染并傳代，此法相當于一般微生物的傳代培養(yǎng)保藏法。病毒等微生物亦可用其它方法如液氮保藏法與冷凍干燥保藏法進行保藏。5、冷凍保藏法冷凍保藏法可分為低溫冰箱（-20-30C,-50-80C）、干冰快速凍結(jié)（約-70C）和液氮（-196C）等保藏法。液氮法保存效果良好,但需要特殊設備。6、冷凍干燥保藏法先使微生物在極低溫度（-70C左右）下快速冷凍、然后在減壓下利用升華現(xiàn)象除去水分（真空干燥）。此法為微生物保藏方法中最有效的方法之一。適用于菌種長期保存,一般保存數(shù)年至數(shù)十年,但設備和操作多很復雜。有些方法如濾紙保藏法、液氮保藏法和冷凍干燥保藏法等均需使用保護劑來制備細胞懸液,以防止因冷凍或水份不斷升華對細胞的損害。保護性溶質(zhì)可通過氫和離子