VIG病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)(課件)

1、1感謝您的閱覽VIG病毒誘導(dǎo)基因沉默技術(shù)2What are RNAi?RNA干擾廣泛存在于生物界，在不同物種中RNA干擾被賦予不同的名稱(chēng):在植物體中被稱(chēng)為基因共抑制（co-suppression）在真菌中被稱(chēng)為基因阻抑（qulling）在動(dòng)物體內(nèi)被稱(chēng)為RNA（RNAi）現(xiàn)今用于植物RNAi技術(shù)按導(dǎo)入方式的不同有粒子轟擊、病毒誘導(dǎo)基因沉默(VIGS)、農(nóng)桿菌介導(dǎo)等方式。.3Virus Induced Gene Silencing(VIGS)病毒誘導(dǎo)的基因沉默(virus induced gene silencing,VIGS)是指通過(guò)對(duì)已知植物病毒的改造，將目標(biāo)基因片段整合入病毒載體中，然后侵染

2、植物,誘發(fā)RNAi途徑,隨著病毒的復(fù)制和轉(zhuǎn)錄而特異性地誘導(dǎo)序列同源基因mRNA降解或被甲基化等修飾，從而引起植物表型或生理指標(biāo)變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)該功能基因的鑒定。 .4VIGS原理 dsRNA:雙鏈RNA; Dicer酶:核糖核酸酶 (Ribonuclease, RNase ) 家族的成員; siRNA:小干擾RNA ; RISC:RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體.5VIGS應(yīng)用的載體利用植物病毒作為載體的優(yōu)點(diǎn):病毒能吸附到完整的植物細(xì)胞并將它們的核酸導(dǎo)入到細(xì)胞中感染的植物細(xì)胞產(chǎn)生大量的病毒，因此重組病毒載體可以高效表達(dá)轉(zhuǎn)入的外源基因。病毒感染可以蔓延整個(gè)植株病毒感染快.6VIGS應(yīng)用的載體RNA病毒(最早最多

3、)1995,首次基于煙草花葉病毒TMV載體構(gòu)建(攜帶八氫番茄紅素脫氫酶PDS侵染煙草，上位葉片褪綠白化)1998,馬鈴薯X病毒PVX(沉默PDS誘發(fā)白化效應(yīng))2001,煙草脆裂病毒TRV(因其具有病毒癥狀較輕、沉默效率高、持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)、能夠侵染分生組織應(yīng)用，目前應(yīng)用最廣泛VIGS載體)PDS即八氫番茄紅素脫氫酶，是類(lèi)胡卜素合成所必需的酶，具保護(hù)葉綠素免受光漂白的作用，而PDS基因發(fā)生沉默后被侵染植物就會(huì)表現(xiàn)出光漂白癥狀。PDS表型變異易于辨別，因此PDS基因成為VIGS體系評(píng)價(jià)的參照基因。.7VIGS應(yīng)用的載體DNA病毒(載體構(gòu)建簡(jiǎn)便、無(wú)需體外轉(zhuǎn)錄、操作難度低)1998,基于雙生病毒番茄金色花葉

4、病毒TGMV的VIGS體系成功建立(第一例DNA病毒載體)2004,非洲木薯花葉病毒ACMV2008,棉花皺葉病毒CLCrV2010,水稻東格魯桿狀病毒RTBV(實(shí)現(xiàn)農(nóng)桿菌介導(dǎo)接種高效沉默水稻內(nèi)源基因PDS，第1例能夠通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)接種水稻的VIGS載體).8VIGS應(yīng)用寄主寄主范圍有限，針對(duì)不同的寄主植物往往需要開(kāi)發(fā)不同的病毒載體。2002，大麥抑制PDS（大麥條紋花葉病毒BSMV，進(jìn)一步在小麥上應(yīng)用）2006，水稻、大麥和玉米（雀麥花葉病毒BMV2006，大豆（多組分病毒菜豆莢斑駁病毒BPMV）2010，大豆（改造后無(wú)需體外轉(zhuǎn)錄，增加沉默效率）.9VIGS的應(yīng)用抗旱研究中相關(guān)基因的功能分析

5、2011，沉默小麥上S-腺苷甲硫氨酸合成酶基因(SAMS)、S-腺苷甲硫氨酸脫羧酶基因(SAMDC)、-谷氨酰半胱氨酸合成更美基因(-ECS)三個(gè)基因。沉默植株經(jīng)干旱脅迫后較正常植株在形態(tài)上有明顯的變化，其葉片的卷曲萎蔫程度較為突出，說(shuō)明這三個(gè)基因在小麥抗干旱脅迫中具有重要功能。.10VIGS的應(yīng)用品質(zhì)改良相關(guān)基因的功能分析2012，利用VIGS技術(shù)發(fā)現(xiàn)高分子量谷蛋白亞基HMV-GS 1Bx14和小麥籽粒中麥谷蛋白聚合體合成有關(guān)。這也是首次報(bào)道VIGS技術(shù)應(yīng)用于小麥穗子和籽粒相關(guān)的基因功能，同時(shí)這個(gè)體系的建立將會(huì)對(duì)研究與籽粒品質(zhì)和在小麥漸成的籽粒中有關(guān)基因的功能起到很大幫助作用。.11VIGS優(yōu)點(diǎn) 在未獲取全長(zhǎng)序列甚至事先不知道序列的情況下即可進(jìn)行VIGS分析。 操作簡(jiǎn)便，能快速獲取表型。 無(wú)需構(gòu)建轉(zhuǎn)基因植株。這對(duì)于那些轉(zhuǎn)基因植株獲取非常困難的植物種類(lèi)來(lái)說(shuō)至關(guān)重要可用于突變致死的基因功能研究。可用于功能冗余基因的功能研究。可用于快速的不同植物種類(lèi)間比較基因組學(xué)的研究。.12VIGS缺陷 VIGS引起目標(biāo)基因的沉默特征不具有遺傳性，以致VIGS技術(shù)并不能徹底揭示基因的功能，這是此種技術(shù)自身最大的局限性。 如何獲得目標(biāo)基因的系統(tǒng)性沉默仍然是VIGS技術(shù)目前需要解決的問(wèn)題。 沉默持續(xù)的時(shí)間問(wèn)題。 病毒載體如何有效地接