乳腺癌外周血 Midkine mRNA的表達(dá)及其臨床意義的研究

1、乳腺癌外周血 Midkine mRNA的表達(dá)及其臨床意義的研究【摘要】目的：檢測(cè)乳腺癌患者血清中期因子(idkine，K)RNA的表達(dá)，討論乳腺癌患者血清中KRNA表達(dá)的意義。方法：應(yīng)用RT-PR方法檢測(cè)42例乳腺癌患者血清中KRNA的表達(dá)，并與25例良性乳腺疾病患者血清對(duì)照。結(jié)果：42例乳腺癌患者中78.5733/42外周血可檢測(cè)出KRNA，而對(duì)照組中只有8.70%2/33陽(yáng)性表達(dá)2=31.283，P0.001。在乳腺癌患者中，KRNA的表達(dá)與浸潤(rùn)程度、淋巴轉(zhuǎn)移有關(guān)P0.05，與腫瘤直徑的大孝腫瘤分化等級(jí)無(wú)關(guān)P0.05。結(jié)論：乳腺癌患者血清中KRNA的表達(dá)與腫瘤的生成、開(kāi)展及轉(zhuǎn)移、浸潤(rùn)程度有

2、關(guān)，有望成為判斷乳腺癌轉(zhuǎn)移、復(fù)發(fā)的重要指標(biāo)。【關(guān)鍵詞】乳腺腫瘤中期因子基因淋巴轉(zhuǎn)移【ABSTRAT】0bjetive：Tdetettheexpressinfidkine(K)RNAinserufpatientsithbreastanerandevaluateitssignifianeethds：TheexpressinfKRNAin42asesfbreastanerand25asesfbenignbreastdiseaseseredetetedinbldsaplesusingreversetransriptinplyerasehainreatin(RT-PR)Results：Angthe42a

3、sesfbreastaner,33ases78.57ereKRNApsitive,hilenly2psitiveasesinbenignbreastdiseases2=31.283，P0.001.ThereassignifiantlyrrelatinsbeteenitsexpressinandinfiltratinandlyphndeetastasisP0.05，buttursizeanddifferentiatindegreeereunrelated(P0.05).nlusin：KRNAplaysaniprtantrleintheturigenesis,prgressin,etastasis

4、andinfiltratinfbreastaner.【KEYRDS】BreastturidkineGeneLyphndeetastasis乳腺癌是我國(guó)女性最常見(jiàn)的惡性腫瘤之一。乳腺腫瘤的生長(zhǎng)是個(gè)長(zhǎng)期過(guò)程，往往在明確診斷時(shí)已出現(xiàn)了遠(yuǎn)處的微轉(zhuǎn)移，討論如何早期檢測(cè)乳腺癌的轉(zhuǎn)移是當(dāng)前研究的熱點(diǎn)之一。最新研究發(fā)現(xiàn)，肝素結(jié)合性生長(zhǎng)因子中期因子idkine,K在乳腺癌中的高表達(dá)是促進(jìn)腫瘤生長(zhǎng)、開(kāi)展的重要因素，并且與腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移關(guān)系親密1。本研究采用RT-PR方法檢測(cè)乳腺癌患者外周血清KRNA的表達(dá)，討論其在乳腺癌發(fā)生過(guò)程的臨床意義。1資料與方法1.1一般資料搜集山東大學(xué)附屬千佛山醫(yī)院甲狀腺乳腺外科2022

5、年7月2022年7月乳腺癌患者42例，均為女性，年齡2879歲，中位年齡46歲。所有病例均按照美國(guó)癌癥結(jié)合委員會(huì)乳腺癌TN分期2022年版進(jìn)展分類(lèi)，其中期18例，期13例，期9例，期2例；組織學(xué)類(lèi)型：浸潤(rùn)性導(dǎo)管癌32例，導(dǎo)管內(nèi)癌7例，鱗狀細(xì)胞癌1例，髓樣癌1例，黏液腺癌1例；腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移31例，無(wú)轉(zhuǎn)移11例。另選25例同期來(lái)我院檢查治療的良性乳腺疾病患者為對(duì)照組。所有病例均為病理組織學(xué)檢查確診，采血前均未承受化學(xué)治療和放射治療。1.2試劑與儀器主要儀器和試劑包括淋巴細(xì)胞別離液和焦碳酸二乙酯南京生興生物技術(shù)，TRIZLPrega公司，RT-PR試劑盒Prega公司，基因擴(kuò)增儀T25/H，杭州博

6、日科技。引物設(shè)計(jì)合成參照相關(guān)文獻(xiàn)及NBI檢索信息2，由上海生物工程公司提供人工合成。K引物序列:上游5-ATGAGAGAGGTTT-3，下游5-ATAGGTTGGGTTAGT-3；-atin引物序列：上游5-TGGATTGAGAAGAGAT-3，下游5-GTTTTTGGAAGTTAGG-3.1.3檢測(cè)方法1.3.1細(xì)胞提取抽取入選患者外周血5.0L，枸櫞酸鈉抗凝，為防止因針頭在穿刺中沾染上皮細(xì)胞而導(dǎo)致假陽(yáng)性結(jié)果，在抽取樣本血前棄血1L。所有抗凝管、注射器、Tip頭、1.5L離心管及0.2LPR薄壁管均經(jīng)焦碳酸二乙酯水處理，去除RNA酶。用淋巴細(xì)胞別離液進(jìn)展有核細(xì)胞的別離，再參加Trizl試劑后

7、放入-80冰箱保存?zhèn)溆谩?.3.2RNA提取標(biāo)本血的單個(gè)核細(xì)胞中參加Trizl1L，室溫放置5in，參加0.2L氯仿，室溫震蕩15s，放置5in，412000r/in離心15in，汲取上清液至另一管中，參加0.5L異丙醇，室溫下放置30in，410000r/in離心5in。棄上清，參加75%乙醇1L，振蕩器混勻，47500r/in離心5in，棄上清，然后用無(wú)RNA酶水溶解，吸頭沖吸混勻，置于556010in使其充分溶解。在分光光度計(jì)上檢測(cè)A260/A280的比值，計(jì)算所提總RNA的含量。1.3.3RT-PR1逆轉(zhuǎn)錄反響：使用RT-PR試劑盒，總體系10L按5030in、995in和55in的步

8、驟分別合成DNA。2PR反響：總體系20L，在PR儀中擴(kuò)增，反響條件為94，2in一個(gè)循環(huán)，9430s，6030s，7260s，共30個(gè)循環(huán);725in延伸。PR擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)。3PR產(chǎn)物測(cè)定：PR產(chǎn)物5L上樣于2%瓊脂糖凝膠0.5g/L溴化乙錠，5V/電泳，電泳緩沖液1TBE。DNAarker的指示下，相應(yīng)位置447bp出現(xiàn)肉眼可見(jiàn)的條帶為陽(yáng)性。1.4統(tǒng)計(jì)學(xué)分析采用SPSS10.0軟件包對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)展2檢驗(yàn)，P0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。2結(jié)果2.1兩組患者血清中KRNA的陽(yáng)性表達(dá)率的比擬乳腺癌患者血清中KPNA陽(yáng)性表達(dá)率為78.57%33/42，高于對(duì)照組8.70%2/25，

9、差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義P0.001。RT-PR產(chǎn)物的電泳結(jié)果中對(duì)照組未見(jiàn)陽(yáng)性條帶，乳腺癌組約447bp處可見(jiàn)陽(yáng)性條帶圖1。2.2乳腺癌患者血清KRNA表達(dá)與臨床病理特征的關(guān)系乳腺癌患者血清中KRNA的陽(yáng)性表達(dá)與組織學(xué)類(lèi)型、腋窩淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移情況呈顯著相關(guān)P0.05，而與腫瘤大孝組織學(xué)分級(jí)、TN分期無(wú)顯著相關(guān)性P0.05，表1。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.3討論K是一個(gè)分泌性的堿性肝素結(jié)合蛋白，主要由兩個(gè)基團(tuán)組成，N端基團(tuán)是細(xì)胞外分泌所必需的信號(hào)肽，能保護(hù)端免受蛋白水解酶降解；端基團(tuán)具有與視黃酸結(jié)合、促神經(jīng)突生長(zhǎng)及增強(qiáng)大動(dòng)脈內(nèi)皮細(xì)胞纖溶酶原激活物活性的作用，可以促進(jìn)血管的形成1。成年期K在正常組織中不表達(dá)或者

10、低表達(dá)3。但在許多惡性腫瘤中K可表達(dá)增強(qiáng)，如食管癌、胃癌、結(jié)直腸癌等，并且在腫瘤的早期、埋伏期和癌前病變階段也呈高程度表達(dá)，提示K在腫瘤的發(fā)生和生物學(xué)行為中起重要作用4-6。有研究說(shuō)明，KRNA在癌組織及癌旁正常組織均陽(yáng)性表達(dá)，但癌組織的表達(dá)程度顯著高于正常組織7。本研究應(yīng)用RT-PR方法檢測(cè)42例乳腺癌患者外周血的KRNA表達(dá)情況，結(jié)果顯示乳腺癌組患者中外周血KRNA陽(yáng)性表達(dá)率78.57%顯著高于乳腺良性疾病組8.70%，乳腺癌患者外周血中存在表達(dá)K的腫瘤細(xì)胞。本研究中期乳腺癌患者KRNA的陽(yáng)性率為72.22，說(shuō)明早期乳腺癌患者的血清中KRNA高表達(dá)，提示乳腺癌早期即可能存在腫瘤細(xì)胞的擴(kuò)散。

11、、期患者KRNA陽(yáng)性率分別增加到76.92和88.89，期甚至達(dá)100%，提示乳腺癌分期越高，其血清KRNA的陽(yáng)性表達(dá)越明顯。KRNA在腫瘤早期患者血清中即有明顯表達(dá)，對(duì)于乳腺癌早期診斷有一定意義，癌細(xì)胞的區(qū)域淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有重要的生物學(xué)免疫功能，但不是癌細(xì)胞濾過(guò)的重要屏障，血行播散更具有重要意義。本研究結(jié)果顯示KRNA在有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的乳腺癌患者血清中表達(dá)明顯高于無(wú)淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的患者，提示乳腺癌患者外周血中KRNA的表達(dá)對(duì)于提早發(fā)現(xiàn)乳腺癌患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有重要意義，該腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的惡性生物學(xué)行為，可促進(jìn)腫瘤的浸潤(rùn)轉(zhuǎn)移。有研究說(shuō)明在惡性腫瘤患者中KRNA可以促進(jìn)腫瘤血管的生長(zhǎng)，并且可以激發(fā)血管

12、內(nèi)皮細(xì)胞生長(zhǎng)因子-vasularendthelialgrthfatr，VEGF-促進(jìn)淋巴轉(zhuǎn)移8。此外，本研究中乳腺癌患者外周血中KRNA表達(dá)陽(yáng)性率與腫瘤直徑、組織學(xué)分級(jí)等臨床病理特征無(wú)顯著相關(guān)性?？傊?，KRNA在乳腺癌患者外周血中的高表達(dá)可為乳腺癌的早期診斷、治療及判斷病情預(yù)后等方面提供有效的客觀指標(biāo)。【參考文獻(xiàn)】1羅祥基，殷正豐，吳孟超中期因子及其與腫瘤的關(guān)系J臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，1999，15(5)：441-4432KanaeT，KadatsuK，AndeK,etal.TheexpressinftrunatedKinthehuanturJBiheBiphyResun,1996,219(1

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