不同茶菌發(fā)酵液對(duì)病原細(xì)菌抑制作用的比較分析

1、PAGE PAGE - 13 -不同茶菌發(fā)酵液對(duì)病原細(xì)菌抑制作用的比較分析紅茶菌(kombucha)，又稱茶菌，是以糖茶水為原料，經(jīng)由酵母、醋酸菌和乳酸菌組成的共生菌群發(fā)酵而成的傳統(tǒng)發(fā)酵茶飲料1。用來發(fā)酵紅茶菌的茶葉一般為紅茶，大量文獻(xiàn)報(bào)道也可以利用其他原料來替代紅茶，如不同類型茶葉、水果、草藥和香料等，開發(fā)出新型風(fēng)味和功能的產(chǎn)品2-3。銀杏是一種廣泛分布在我國的藥食同源植物，其葉片中化學(xué)物質(zhì)種類繁多、含量豐富，活性成分如黃酮類化合物(16.6mg/g)多達(dá)20幾種，萜類和總多酚含量分別占比0.42%和6.89%，必需氨基酸含量約占總氨基酸含量的40%，維生素、微量元素和酚酸類含量占比也很高4

2、。有研究發(fā)現(xiàn)銀杏葉的主要提取物，如多糖類、黃酮類化合物和銀杏酚酸對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌有明顯的抑制作用5-6。使用替代原料在發(fā)酵過程中不僅可以為茶菌的生長提供碳、氮源，其成分的生物轉(zhuǎn)化也賦予茶菌不同的理化性質(zhì)和更強(qiáng)的生物活性2-3。紅茶菌發(fā)酵液能有效抑制革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌生長7，但對(duì)霉菌的抑制作用有限8。目前對(duì)茶菌發(fā)酵液的抑菌作用研究基本集中在對(duì)抗生素敏感性致病菌，如金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌、大腸桿菌和幽門螺桿菌等的敏感性菌株9，而對(duì)耐藥菌的抑菌效果研究很少。病原菌的耐藥性問題日趨嚴(yán)重，究其原因是抗菌藥物的濫用，其中大腸桿菌與鮑曼不動(dòng)桿菌傳播廣泛，極易對(duì)抗生素產(chǎn)生耐藥性

3、，在外界不斷刺激下，亦可產(chǎn)生多重耐藥性10-11，如何有效抑制及感染后治療是目前亟待解決的難題。本研究以紅茶、綠茶和銀杏葉3種材料制備茶菌發(fā)酵液，觀察并檢測(cè)發(fā)酵液的理化性質(zhì)；采用瓊脂擴(kuò)散法和牛津杯法體外檢測(cè)3種茶菌發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、肺炎鏈球菌等病原細(xì)菌的敏感性菌株和大腸桿菌、鮑曼不動(dòng)桿菌的多重耐藥菌株的抑制效果；并選取銅綠假單胞桿菌和大腸桿菌T5菌株，探究不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)銀杏茶菌發(fā)酵液抑菌效果的影響。通過有益微生物的發(fā)酵作用提高茶葉和銀杏的抑菌生理活性，發(fā)展對(duì)病原細(xì)菌(特別是耐藥菌)具有抑制作用的功能微生物發(fā)酵產(chǎn)品。以期在大力倡導(dǎo)減少抗生素濫用的背景下，為新型食品防腐劑和抑菌藥物

4、的開發(fā)提供理論基礎(chǔ)。1材料與方法1.1供試菌株和培養(yǎng)基紅茶菌菌種、大腸桿菌(Escherichiacoli)01菌株、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)、銅綠假單胞桿菌(Pseudomonasaeruginosa)、肺炎鏈球菌(Streptococcuspneumoniae)、痤瘡丙酸桿菌(Propionibacteriumacnes),由福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供;多重耐藥性菌株大腸桿菌T5(耐氨芐青霉素、氯霉素、慶大霉素和妥布霉素)、大腸桿菌P1-D6(耐氨芐青霉素、氯霉素和慶大霉素)和鮑曼不動(dòng)桿菌(A

5、cinetobacterbaumannii，耐慶大霉素、妥布霉素、瀏陽霉素、卡那霉素和氨芐青霉素)，由福建師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院付新苗教授惠贈(zèng)。所有菌株使用前暫存于-4冰箱。LB液體培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，氯化鈉5.0，121滅菌30min。LB固體培養(yǎng)基(g/L)：胰蛋白胨10.0，酵母提取物5.0，氯化鈉10.0，瓊脂20，121滅菌30min。哥倫比亞血瓊脂平板培養(yǎng)基購自成都彼樣生物科技有限公司。紅茶糖水培養(yǎng)液：紅茶5g，白砂糖40g，蒸餾水800mL。綠茶糖水培養(yǎng)液：綠茶5g，白砂糖40g，蒸餾水800mL。銀杏茶糖水培養(yǎng)液(g/L)：銀杏5g，白砂糖40g

6、，蒸餾水800mL。1.2茶葉及試劑紅茶、綠茶、銀杏葉，福建省福州市市場(chǎng)；氫氧化鈉、酵母浸膏、瓊脂等，國藥化學(xué)試劑公司；細(xì)菌學(xué)蛋白胨，廣東環(huán)凱微生物公司。1.3供試菌培養(yǎng)挑取1環(huán)供試菌(芽孢桿菌、銅綠假單胞菌、鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸桿菌T5、01、P1-D6、痤瘡丙酸桿菌)在LB固體平板上劃線，劃線后平板置于37恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24h，然后挑選大小適中的單菌落通過劃線進(jìn)行2次純化培養(yǎng)。從純化的平板上挑取菌體接種于50mLLB液體培養(yǎng)基內(nèi)，置于搖床37，220r/min培養(yǎng)24h后，獲得菌懸液。肺炎鏈球菌活化，挑取1環(huán)肺炎鏈球菌在哥倫比亞血瓊脂平板上劃線，劃線平板置于37，5%10%CO2恒溫培養(yǎng)箱培

7、養(yǎng)24h，然后挑選單菌落通過劃線進(jìn)行2次純化培養(yǎng)。用移液槍吸取1mL無菌水于純化的平板上，并用接種環(huán)刮取菌體混于無菌水中，制備菌懸液。1.4茶菌發(fā)酵及樣品制備參照汪鵬輝等12的方法培養(yǎng)茶菌和制備發(fā)酵液樣品。發(fā)酵液分別以紅茶、綠茶、銀杏為原料。首先用沸水將所用器具紗布等清潔殺菌，在800mL沸水中分別加入5g紅茶、綠茶和銀杏葉，待浸泡10min后用4層滅菌紗布過濾，在濾液中加入40g白砂糖，充分?jǐn)嚢璧玫教遣杷４遣杷鋮s至室溫后，用ddH2O補(bǔ)充至800mL。在無菌環(huán)境中加入200mL發(fā)酵710d的茶菌母液，混勻，并以4層滅菌紗布封口，在28恒溫培養(yǎng)箱中發(fā)酵7d，得到茶菌發(fā)酵液。茶菌發(fā)酵液經(jīng)濾

8、紙過濾去除發(fā)酵液中較大顆粒雜質(zhì)后，8000r/min離心5min，取上清液用孔徑0.22m的濾膜過濾。收集濾液至100mL，經(jīng)凍干處理48h后得到發(fā)酵液干粉，用1mL無菌水稀釋，存放于-20待用。1.5茶菌發(fā)酵過程觀察和理化指標(biāo)測(cè)定茶菌發(fā)酵后，每天觀察發(fā)酵液的變化，至發(fā)酵后7d記錄發(fā)酵液中菌膜、發(fā)酵液渾濁度、風(fēng)味的數(shù)據(jù)；測(cè)定發(fā)酵液OD值、pH值、酸度和還原糖含量12。1.6抑菌試驗(yàn)采用牛津杯-瓊脂擴(kuò)散法檢測(cè)不同茶菌樣品的抑菌能力13。LB培養(yǎng)基于超凈工作臺(tái)中混勻倒平板并冷卻至室溫后，加入100L供試菌懸浮液，涂布均勻。將滅菌后的牛津杯用無菌鑷子固定在涂布有供試菌懸液的培養(yǎng)基平板上，每個(gè)平板中放

9、置3個(gè)牛津杯。待牛津杯固定后，向杯中加入200L以上凍干后稀釋的發(fā)酵液，置于37下恒溫培養(yǎng)24h。觀察有無抑菌作用，測(cè)量并記錄抑菌圈的大小。將100L肺炎鏈球菌懸浮液涂布于哥倫比亞血瓊脂平板上，用直徑為9mm的無菌打孔器在哥倫比亞血瓊脂平板上打孔，每孔加入200L發(fā)酵液樣品，置于37，5%10%CO2恒溫培養(yǎng)箱恒溫培養(yǎng)24h后。觀察抑菌圈的大小并做記錄。將平板倒置于光線充足處，用游標(biāo)卡尺“十”字法測(cè)量抑菌圈大小，并計(jì)算相對(duì)抑菌圈大小。相對(duì)抑菌圈大小計(jì)算如公式(1)所示：相對(duì)抑菌圈/mm=D-d(1)式中：D，抑菌圈直徑，mm；d，打孔器直徑，mm。1.7發(fā)酵時(shí)間對(duì)茶菌抑菌作用的影響按以上銀杏培

10、養(yǎng)液的配方和培養(yǎng)方法，分別在發(fā)酵后第5、9、13、17、21天取樣，發(fā)酵液經(jīng)過濾滅菌和凍干處理，編號(hào)后放置冰箱凍藏。按以上抑菌試驗(yàn)方法觀察和測(cè)定不同發(fā)酵時(shí)間樣品對(duì)銅綠假單胞桿菌和大腸桿菌T5菌株的抑制效果。1.8數(shù)據(jù)處理及分析實(shí)驗(yàn)圖像采用圖像分析軟件AdobeIllustrator進(jìn)行處理。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用數(shù)據(jù)分析軟件GraphPadPrism6和Oringin8.0進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析和作圖。所得的結(jié)果表示為平均值標(biāo)準(zhǔn)誤差2結(jié)果與分析2.1發(fā)酵液理化性質(zhì)比較經(jīng)多次預(yù)試驗(yàn)，紅茶菌在銀杏葉粉配制的糖水培養(yǎng)液中生長良好，培養(yǎng)514d，在培養(yǎng)液表面形成明顯的菌膜。因此，進(jìn)一步比較茶菌在不同原料配制的培養(yǎng)液中的表

11、現(xiàn)。發(fā)酵7d后，觀察和測(cè)定紅茶、綠茶、銀杏發(fā)酵液的理化表現(xiàn)和數(shù)據(jù)如表1所示。在綠茶和紅茶配制的茶糖水培養(yǎng)液中，菌體生長明顯，發(fā)酵后第2天即可見培養(yǎng)液中不斷產(chǎn)生細(xì)小氣泡，發(fā)酵后第3天在培養(yǎng)液表面形成明顯的菌膜。在銀杏糖水培養(yǎng)液中，菌體生長較慢，氣泡產(chǎn)生遲，數(shù)量也相對(duì)較少；菌膜的形成相比綠茶和紅茶糖水培養(yǎng)液慢，菌膜薄。未溶解的銀杏固形物易被絮狀的膜吸附，使發(fā)酵液變澄清。銀杏糖水經(jīng)發(fā)酵后更加清亮，具有酸甜風(fēng)味和清香。銀杏糖水發(fā)酵液在色、香、味方面要優(yōu)于紅茶與綠茶，但銀杏茶菌的生長較慢，培養(yǎng)周期略長。發(fā)酵7d后，紅茶、綠茶和銀杏發(fā)酵液的pH值分別為3.08、2.83和2.75。表1發(fā)酵7d后3種茶菌發(fā)

12、酵液理化性質(zhì)比較Table1Comparisonofphysicochemicalpropertiesofthreedifferentkombuchateaafter7daysoffermentation2.2茶菌發(fā)酵液對(duì)病原細(xì)菌的抑制作用以紅茶為原料的茶菌發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌和痤瘡丙酸桿菌的相對(duì)抑菌圈直徑分別為4.5、4.33、16.7mm(表2，圖1)，對(duì)痤瘡丙酸桿菌的抑制效果最為明顯；對(duì)枯草芽孢桿菌、大腸桿菌01菌株、大腸桿菌T5和大腸桿菌P1-D6等菌株沒有抑制效果。以綠茶為原料的茶菌發(fā)酵液對(duì)供試的銅綠假單胞桿菌、大腸桿菌和金黃色葡萄球菌等菌株均有抑制作用；其中，對(duì)銅綠

13、假單胞桿菌的抑制效果最為明顯，抑菌圈直徑達(dá)到23.33mm，與其他菌株相比差異顯著(P0.05)。和紅茶為原料的發(fā)酵液相比，以綠茶為原料的發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌多重耐藥菌株T5和P1-D6也有較強(qiáng)的抑制作用，相對(duì)抑菌圈直徑達(dá)到18mm左右(表2)。表2茶菌發(fā)酵液對(duì)致病菌的抑制作用Table2InhibitoryeffectsofteafungusbrothongrowthofpathogenicbacteriaN=3)注：相同小寫字母表示差異不顯著(P0.05)，不同小寫字母表示差異顯著(P0.05)(下同)A-紅茶菌發(fā)酵液對(duì)銅綠假單胞菌的抑制作用；B-紅茶菌發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用；C-紅

14、茶菌發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌T5菌株的抑制作用；D-綠茶菌發(fā)酵液對(duì)銅綠假單胞菌的抑制作用；E-綠茶菌發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用；F-綠茶菌發(fā)酵液對(duì)大腸桿菌T5菌株的抑制作用圖1茶菌發(fā)酵液對(duì)病原菌的抑菌作用比較Fig.1Inhibitoryeffectsofteafungusbrothongrowthofpathogenicbacteria2.3銀杏茶菌發(fā)酵液對(duì)病原細(xì)菌的抑制作用2.3.1對(duì)敏感菌的抑制效果銀杏茶菌發(fā)酵液對(duì)金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌01菌株等抗生素敏感菌株的相對(duì)抑菌圈大小分別為21.67、12.50、2.03、4.33mm(圖2)。銀杏茶菌發(fā)酵液對(duì)3株肺炎

15、鏈球菌也有一定的抑制效果。對(duì)型肺炎鏈球菌、型肺炎鏈球菌和型肺炎鏈球菌的相對(duì)抑菌圈大小分別為3.67、9.83、6.50mm(圖2)。A-銀杏茶菌發(fā)酵液對(duì)不同病原細(xì)菌抑菌圈大小比較；B-銀杏茶菌對(duì)金黃色葡萄球菌的抑制作用；C-銀杏茶菌對(duì)型肺炎鏈球菌的抑制作用圖2銀杏茶菌發(fā)酵液對(duì)病原細(xì)菌的抑菌作用Fig.2Inhibitoryeffectsofginkgokombuchabrothongrowthofpathogenicbacteria2.3.2對(duì)多重耐藥菌的抑制效果銀杏茶菌發(fā)酵液對(duì)多重耐藥性菌株鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸桿菌T5和大腸桿菌P1-D6的相對(duì)抑菌圈大小分別為7.83、13.00、15.33m

16、m(圖2-A，圖3)。A-大腸桿菌T5菌株；B-大腸桿菌P1-D6菌株；C-鮑曼不動(dòng)桿菌圖3銀杏茶菌發(fā)酵液對(duì)多重耐藥菌的抑菌作用Fig.3Inhibitoryeffectsofginkgokombuchaongrowthofmultidrugresistantbacteria2.4發(fā)酵時(shí)間對(duì)銀杏茶菌抑菌作用的影響在17d的發(fā)酵時(shí)間內(nèi)，銀杏茶菌發(fā)酵液的抑菌作用隨時(shí)間變化而增強(qiáng)；發(fā)酵后第17天對(duì)銅綠假單胞菌和大腸桿菌T5抑制作用最強(qiáng)，抑菌圈大小分別達(dá)到2.91、3.69cm(表3，圖4)。但是，發(fā)酵后21d進(jìn)一步觀察發(fā)現(xiàn)，在抑菌圈的范圍內(nèi)，逐漸可見有細(xì)菌的生長，抑菌效果逐漸較弱。表3發(fā)酵時(shí)間對(duì)銀杏

17、茶菌抑菌效果的影響單位：cmTable3Effectoffermentationtimeonantibacterialeffectofginkgokombucha注：-表示未出現(xiàn)抑菌圈A-發(fā)酵5d銀杏茶菌對(duì)銅綠假單胞桿菌的抑制作用；B-發(fā)酵9d銀杏茶菌對(duì)銅綠假單胞桿菌的抑制作用；C-發(fā)酵17d銀杏茶菌對(duì)銅綠假單胞桿菌的抑制作用;D-發(fā)酵5d銀杏茶菌對(duì)大腸桿菌T5菌株的抑制作用；E-發(fā)酵9d銀杏茶菌對(duì)大腸桿菌T5菌株的抑制作用；F-發(fā)酵17d銀杏茶菌對(duì)大腸桿菌T5菌株的抑制作用圖4不同發(fā)酵時(shí)間對(duì)銀杏茶菌抑菌作用的影響Fig.4Effectsoffermentationtimeoninhibiti

18、onactivitiesofginkgokombucha3結(jié)論本研究結(jié)果顯示，3種茶菌發(fā)酵液對(duì)不同細(xì)菌的抑菌活性存在顯著差異。綠茶菌發(fā)酵液對(duì)供試病原細(xì)菌的敏感菌株和耐藥菌株均有明顯的抑制作用，其中對(duì)銅綠假單胞菌的抑制活性最強(qiáng)，對(duì)大腸桿菌01菌株的抑制活性最弱；銀杏茶菌發(fā)酵液對(duì)敏感菌株和耐藥菌株均有抑制作用，對(duì)金黃葡萄球菌的抑制活性最強(qiáng)，對(duì)大腸桿菌01菌株的抑制活性最弱。而紅茶菌發(fā)酵液只對(duì)痤瘡丙酸桿菌、金黃葡萄球菌和銅綠假單胞菌有一定的抑制作用，對(duì)芽孢桿菌和鮑曼不動(dòng)桿菌、大腸桿菌T5和大腸桿菌P1-D6等3個(gè)耐藥菌株均無抑菌活性?？傮w上，3種茶菌發(fā)酵液的抑菌活性強(qiáng)弱依次為：綠茶菌銀杏茶菌紅茶菌。

19、除了痤瘡丙酸桿菌，綠茶菌發(fā)酵液對(duì)其他供試菌的抑制作用明顯優(yōu)于紅茶菌發(fā)酵液。已有的研究結(jié)果表明，不同茶葉或不同植物經(jīng)紅茶菌發(fā)酵后，其發(fā)酵液的抑菌效果存在差異14-16。如BATTIKH等14評(píng)估了紅茶、綠茶發(fā)酵21d后的抗細(xì)菌和抗真菌活性，發(fā)現(xiàn)對(duì)所測(cè)試的病原微生物(Candidakrusei除外)具有抗菌潛力，而綠茶菌的抑菌潛力最強(qiáng)。與紅茶發(fā)酵后的發(fā)酵液相比，綠茶發(fā)酵液具有更寬的抑菌譜和更強(qiáng)的抑菌活性。紅茶和綠茶發(fā)酵后的抑菌能力存在差異，可能和以下因素有關(guān)：一是不同茶葉和植物葉片所含有的成分存在差異，如綠茶在兒茶素、黃酮類、酚酸類等化合物的種類和含量上與紅茶不同，因而其發(fā)酵后的產(chǎn)物存在差異16-

20、17；經(jīng)茶菌發(fā)酵后，發(fā)酵原料的生物轉(zhuǎn)化產(chǎn)物可能呈現(xiàn)不同的抑菌作用16。二是不同植物原料發(fā)酵后，發(fā)酵液中有機(jī)酸的種類和含量不同。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明綠茶菌發(fā)酵后的酸度顯著高于紅茶菌；pH值的降低及大量有機(jī)酸的產(chǎn)生，尤其乙酸的產(chǎn)生也是茶菌具有抑菌效果的重要機(jī)制之一8-9,18。綠茶菌相比紅茶菌抗菌作用更強(qiáng)，未來可以深入研究其抑菌作用原理，并期望應(yīng)用于醫(yī)療或食品領(lǐng)域。紅茶菌在銀杏糖水中生長良好，發(fā)酵過程中pH值、酸度和還原糖變化與紅茶菌和綠茶菌相似，而菌膜形成表明使用銀杏發(fā)酵是可行的。銀杏葉中含有豐富的化學(xué)物質(zhì)，藥用有效成分多達(dá)170余種19。銀杏葉提取物對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌等革蘭氏陰性和陽性菌均有很好的抑制