硝酸還原酶課件

1、硝酸還原酶硝酸還原酶一.實驗?zāi)康氖煜AS法原理及操作步驟。掌握PAS法顯示的物質(zhì)的性質(zhì)，并觀察多糖在組織細胞中的分布。一.實驗?zāi)康亩?實驗原理多糖(polysaccharide)由多個單糖分子縮合去水而生成的化合物。廣泛分布于動、植物界。一些不溶性的多糖構(gòu)成植物和動物的骨架，如植物的纖維素和動物的甲殼素，一般稱為結(jié)構(gòu)多糖。另一些多糖在生物體內(nèi)作為能量貯存，如淀粉（植物）和肝糖（動物）在需要時可以通過生物體內(nèi)酶系統(tǒng)的作用分解，釋放出單糖。還有許多多糖具有更復(fù)雜多樣的生理功能，如粘多糖、血型物質(zhì)等，它們在生物體內(nèi)起著重要的作用。二.實驗原理多糖(polysaccharide)由多個單糖分二.實驗

2、原理淀粉和糖原均由D葡萄糖的分支或直鏈組成，過碘酸是一種強氧化劑，能將葡萄糖中的乙二醇基(CHOH-CHOH)氧化成兩個游離的醛基(-GHO)，游離醛基與Schiff試劑反應(yīng)生成紫紅色產(chǎn)物。二.實驗原理二.實驗用品1.材料：動物：肝細胞石蠟切片（鼠肝切片） 植物 ：土豆徒手切片 2.器材： 載玻片 、蓋玻片、染色缸、顯微鏡 、小燒杯、膠頭滴管、鑷子二.實驗用品1.材料：2.器材：三.實驗用品 3.試劑1.不同濃度的乙醇溶液、二甲苯。2.過碘酸水溶液：過碘酸4g、95乙醇350ml、1/5mmolL-1乙酸鈉50ml，用純水定容至500ml。配置好后，保存在04的冰箱內(nèi)，瓶外加黑紙保存，此液如顯

3、黃色即失效。三.實驗用品 3.試劑三.實驗用品 3.試劑 3.亞硫酸水（此液中所用的偏重亞硫酸鈉或鉀要與Schiff試劑中所用的相同）：取10偏重亞硫酸鈉（或鉀）20ml、1mmolL-1 HCl 20ml和400ml純水混勻即可。此液使用前配制，否則回因SO2逸出失效。三.實驗用品二.實驗用品 3.試劑 4.Schiff試劑：先將純水600ml煮沸，由大火取下，加入堿性品紅3g，充分?jǐn)嚢?，以助于溶解，待冷卻到50時，過濾到磨口棕色瓶中，加入1mmolL-1 HCl 60ml冷卻到25時加入3g偏重亞硫酸鈉（或鉀）放入暗處，次日取出，加入活性炭3g，過濾備用，用黑紙包好，勿見光，放在低溫處。一

4、般可保存數(shù)月。二.實驗用品三.實驗用品3.試劑5.蘇木精染液(Delafield 蘇木精染液):甲液（蘇木精5g、無水乙醇30ml）、乙液（銨礬即硫酸鋁飽和水溶液：約1g硫酸鋁：11ml水，用時配110ml,取100ml）、丙液（甘油125ml、甲醇125ml）。 配法如下：1.將甲液一滴一滴地加入乙液中，并隨時用玻璃棒攪動；2.然后暴露于陽光和空氣中約一周到十天；3.加入丙液；4.將混合液靜置12月至顏色變深為止（可過濾），此液成熟后須置于陰冷處塞緊瓶口，可長期保存使用，使用時可將染劑一份用35份水稀釋，則染色分化更明顯。三.實驗用品3.試劑四.實驗步驟 二甲苯10100%乙醇3100%乙醇

5、395乙醇390%乙醇380%乙醇370%乙醇350%乙醇3過碘酸1530Schiff試劑1530亞硫酸水5亞硫酸水5亞硫酸水5自來水3蒸餾水3蘇木精染液10流水沖洗50%乙醇3 70%乙醇3 80%乙醇3 90% 3 95%乙醇3 100%乙醇3 100%乙醇+二甲苯3二甲苯5。四.實驗步驟 二甲苯10100%乙醇3100%五.實驗結(jié)果1.鼠肝細胞：細胞核呈藍色位于細胞中央，肝糖原呈紫紅色顆粒狀分布于細胞胞質(zhì)中，并且靠近細胞膜（遠離細胞核中央）一側(cè)聚集相對較多，呈非均勻性分布。2.土豆切片：淀粉顆粒紫紅色或粉紅色，呈油滴狀分布于細胞質(zhì)中。五.實驗結(jié)果六.分析與討論1.關(guān)鍵步驟：過碘酸起氧化作

6、用，使兩個醇基氧化成兩個游離的醛基（過碘酸氧化作用時間稍長，會使反應(yīng)更加充分）；所產(chǎn)生醛基與Schiff試劑反應(yīng)生成紫紅色物質(zhì)（Schiff試劑作用時間略長，會使染色效果明顯，但過長將導(dǎo)致染色太深，也不利于觀察）；蘇木精可將細胞核染成藍色（但時間不宜過長，以免染色太重）。六.分析與討論六.分析與討論2.注意事項：二甲苯溶解性很強，時間要把握好，前者以脫蠟為準(zhǔn)，不要有空氣；后者以透明為準(zhǔn)，如果片子變黑，重新放回二甲苯，再透明一次。試劑重復(fù)使用后，實驗結(jié)果不明顯（脫蠟不完全、染色不好等），因此在實驗前要檢查各試劑是否干凈，如果污染嚴(yán)重，一定要更換。土豆切片的前處理要求迅速，否則由于多酚氧化酶的存在，可將組織中的酚類物質(zhì)氧化成