ERP-9131總大腸桿菌(多管發(fā)酵技術(shù))

1、方法 91 31總大腸桿菌(多管發(fā)酵技術(shù))適用范圍l本方法用于測(cè)定地下水和地表水中存在的大腸桿菌類(lèi)細(xì)菌。|按本方法分析的大腸桿菌類(lèi)細(xì)菌，其定義為：全部能于35在 48h 之內(nèi)使乳糖發(fā)酵，并產(chǎn)生氣體的需氧的和兼性厭氧的、革蘭氏染色陰性的、不形成孢子的桿狀細(xì)菌。方法摘要多管發(fā)酵技術(shù)是一種分三步進(jìn)展的試驗(yàn)方法。結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計(jì)處理以最可能數(shù)(MPN)表示。下面摘要介紹這三個(gè)步驟：假定試驗(yàn)、確信試驗(yàn)和完成試驗(yàn)(為了使分析結(jié)果準(zhǔn)確，需要進(jìn)展五管試驗(yàn))。假定試驗(yàn)：用累進(jìn)量的待測(cè)水樣接種到一系列月桂酰胰蛋白液態(tài)培育基初步 發(fā)酵試管。將接種后的試管于 350.5培育 242h，檢查試管內(nèi)有無(wú)氣體生成。連續(xù)培育無(wú)氣體

2、生成的試管。并在 483h 完畢時(shí)再行檢查。在 483h 內(nèi)只要有氣體生成，不管其量多少均為陽(yáng)性假定試驗(yàn)。I確信試驗(yàn)：在 24 和 48h 內(nèi)顯示有氣體生成的全部初步發(fā)酵試管均應(yīng)進(jìn)展確信試驗(yàn)。用在假定試驗(yàn)中顯示陽(yáng)性結(jié)果的試管中的培育基，接種到含有亮綠乳糖膽汁液態(tài)培育基的發(fā)酵試管，氣體生成后應(yīng)盡快進(jìn)展接種。將接種后的試管于 350.5培育 483h。在這段時(shí)間內(nèi)的任何時(shí)刻有氣體生成即說(shuō)明為陽(yáng)性確信試驗(yàn)。完成試驗(yàn)：在確信試驗(yàn)中顯示陽(yáng)性結(jié)果的全部水樣均應(yīng)進(jìn)展完成試驗(yàn)。對(duì)分 析過(guò)的全部樣品的 20進(jìn)展完成試驗(yàn)，還可作為一種質(zhì)量把握手段。在一個(gè)或數(shù)個(gè)伊紅 亞甲藍(lán)平皿瓊脂上用待分析的樣品畫(huà)線。將畫(huà)線后的平

3、皿于350.5培育 242h。培育以后，將一個(gè)或數(shù)個(gè)典型菌落(即有菌落核心、具有或沒(méi)有金屬光澤)轉(zhuǎn)移到月桂酰胰蛋白液態(tài)培育基發(fā)酵試管和養(yǎng)分瓊脂斜面上。將發(fā)酵試管和瓊脂斜面放于 350.5培育 24 土 2h； 如無(wú)氣體產(chǎn)生則連續(xù)培育至 483h。對(duì)于有氣體生成的發(fā)酵試管，取其相應(yīng)的瓊脂斜面做革蘭氏染色，并用顯微鏡進(jìn)展觀看。假設(shè)在發(fā)酵試管內(nèi)生成氣體，并且在瓊脂培育基上消滅 革蘭氏陰性、不形成孢子的桿狀細(xì)菌，則可認(rèn)為完成試驗(yàn)令人滿足，同時(shí)確認(rèn)被分析的樣品 中存在大腸桿菌類(lèi)細(xì)菌。關(guān)于本方法的具體內(nèi)容，請(qǐng)見(jiàn)“水和廢水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)法”和“環(huán)境監(jiān)測(cè)的微生物學(xué)方法”。3.O 干擾細(xì)菌在水中的分布是無(wú)規(guī)律的。因此

4、，為了獲得足夠的統(tǒng)計(jì)準(zhǔn)確度，本方法要求進(jìn)展五管試驗(yàn)。存在余氯或其它鹵索可阻礙細(xì)菌作用的持續(xù)。為防止消滅這種問(wèn)題，應(yīng)在無(wú)菌樣品容器中入硫代硫酸鈉。水樣中含有高濃度銅、鋅或其它重金屬可使細(xì)菌中毒。只有在疑心水樣中存在重金屬時(shí)才應(yīng)參加螯合劑，例如乙二胺四醋酸(EDTA)。必需牢記，最可能數(shù)表為概率計(jì)算結(jié)果，因而其周密度必定較差。最可能數(shù)表包含 23的正系統(tǒng)誤差，通常會(huì)導(dǎo)致數(shù)值偏高。增加所分析的同一采樣點(diǎn)的樣品數(shù)日，增加所檢驗(yàn)的分取樣品的數(shù)目，都能提高最可能數(shù)的周密度。4.O 儀器和設(shè)備培育箱。培育箱內(nèi)全部位置的溫度在任何時(shí)間都必需保持均勻和穩(wěn)定，即使用區(qū)域內(nèi)的溫差不得大于0.5。為了到達(dá)這種恒溫準(zhǔn)確

5、度，應(yīng)使用帶恒溫水套的或無(wú)水型培育箱，培育箱配備絕緣良好的恒溫把握低溫電熱裝置，電熱裝置安裝在恒溫室四壁后面夾層中或底板下面，也可安裝在其四周；最好配備機(jī)械裝置用以循環(huán)空氣。假設(shè)使用干熱式培育箱，濕度必需保持在 7580。另外，也可使用保溫良好，加熱裝置分布適當(dāng)并配備強(qiáng)制空氣循環(huán)裝置的專(zhuān)用培育室，但其溫差和相對(duì)濕度必需符合要求。使用這種培育室時(shí)，每天應(yīng)記錄培育平皿或試管處的溫度范圍。培育箱配備放開(kāi)露式金屬絲架或板架，其問(wèn)隔應(yīng)能保證整個(gè)室內(nèi)溫度勻一。平皿架或試管筐與四壁應(yīng)保持 2.5cm 問(wèn)距。培育箱內(nèi)每一個(gè)正在使用的架子上，應(yīng)放置一支準(zhǔn)確的溫度計(jì)，其球部浸入液體(甘油、水或礦物油)；記錄每天的

6、溫度數(shù)(最好是在早晨和下午讀數(shù))。另外，在培育箱內(nèi)位于中間的一個(gè)架子上，最好放置一支帶最高和最低溫度記錄的溫度計(jì)，以便記錄 24h 內(nèi)的溫度總范圍。培育箱滿載時(shí)，應(yīng)定時(shí)測(cè)定箱內(nèi)的溫度變化。只要有可能， 就應(yīng)安裝一支自記溫度計(jì)，以便保存一份連續(xù)的、永久的溫度記錄。水銀溫度計(jì)的刻度應(yīng)為 0.5，每年應(yīng)比照國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)局(NBS)檢定合格的溫度計(jì)校準(zhǔn)一次?？潭缺P(pán)溫度計(jì)應(yīng)每季度校準(zhǔn)一次。水浴中的水應(yīng)保持足夠深，能沒(méi)過(guò)試管內(nèi)的培育基液面。干熱滅菌箱。應(yīng)使用尺寸足夠大的干熱滅菌箱，以防內(nèi)部擁擠。滅菌箱的構(gòu)造應(yīng)能保證滅菌溫度均勻并足夠高(17010)，應(yīng)配備適用的溫度計(jì)或溫度記錄儀表。高壓滅菌器。應(yīng)使用尺寸足夠

7、大的高壓滅菌器，以防內(nèi)部擁擠。滅菌器的構(gòu)造應(yīng)能保證滅菌室內(nèi)溫度均勻(直至并包括滅菌溫度 121)；應(yīng)配備準(zhǔn)確的溫度計(jì)，其球部應(yīng)正確地放置在排氣管上，以便記錄滅菌室內(nèi)的最低溫度(也可使用溫度記錄儀表)；應(yīng)配備壓力表和恰當(dāng)?shù)卣{(diào)整好的安全閥，直接與飽和蒸汽動(dòng)力管線或與適用的特制蒸汽發(fā)生器相接(不要使用用胺處理過(guò)的鍋爐供給的蒸汽，以防腐蝕)；滅菌器應(yīng)能在 30min 內(nèi)到達(dá)所需溫度。 I由于調(diào)整和保持滅菌溫度的困難和潛在的危急，建議不使用立式高壓滅菌器或高壓鍋。假設(shè)由于狀況緊急或特別而使用高壓鍋，則必需配備適用的壓力表和溫度計(jì)，其球部應(yīng)位于水面上 2.5cm。茵落計(jì)數(shù)器。使用魁北克(Quebec)式菌

8、落計(jì)數(shù)器，最好為暗視野型；也可使用其它計(jì)數(shù)器，但要能供給相等的放大倍數(shù)(1.5 倍)和令人滿足的可見(jiàn)度。pH 計(jì)準(zhǔn)確度不低于 0.1pH 單位。天平。使用負(fù)載為 150g 時(shí)感量不低于 0.1g 的天平。稱取少量(少于 2g)時(shí)， 使用負(fù)載為 10g 時(shí)感量為lmg 的分析天平。最好使用單盤(pán)快稱天平。培育基制備器皿。使用硼硅玻璃或其它抗腐蝕材料如不銹鋼器皿。使用的玻璃器皿應(yīng)清潔，無(wú)殘?jiān)?、干瓊脂或其它?huì)污染培育基的外來(lái)物質(zhì)。吸管和刻度量筒。使用尺寸適宜，能夠準(zhǔn)確、快速移取所需液量的吸管。同一批產(chǎn)品的核準(zhǔn)誤差不得大于 2.5。使用符合國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)的刻度量筒。吸管容器。使用端面尺寸 57.5cm 的圓筒

9、形或長(zhǎng)約 40cm 的矩形鋁盒或不銹鋼盒，或用優(yōu)質(zhì)硫酸鹽紙漿紙(牛皮紙)。不得用銅或銅合金罐或盒盛放吸管。稀釋瓶或試管。使用耐熱玻璃，最好是硼硅酸鹽玻璃瓶或試管，其密封玻璃塞或螺帽應(yīng)配備在滅菌當(dāng)中不會(huì)產(chǎn)生有毒或抑菌化合物的襯墊。不要用棉塞作塞子。在稀釋瓶或管壁上畫(huà)上擦不掉的記號(hào)?？梢杂贸叽邕m當(dāng)?shù)臒o(wú)毒塑料瓶代替玻璃瓶，但要保證這種瓶在滅菌時(shí)不會(huì)發(fā)生問(wèn)題。培替氏(Petri)培育皿。使用尺寸約為 10015mm 的玻璃或塑料培氏培育皿。培育皿底部應(yīng)平坦，無(wú)氣泡，無(wú)劃痕，以便保證整個(gè)皿內(nèi)培育基的厚度全都。承受濾膜技術(shù)時(shí)，使用松蓋玻璃或塑料平皿(6015mm)或緊蓋平皿(5012mm)。滅菌培替氏平皿

10、 并貯存在金屬罐(鋁或不銹鋼罐，不能用銅罐)中，也可在滅菌以前先用紙，最好是優(yōu)質(zhì)硫酸鹽紙(牛皮紙)包封。發(fā)酸管和小管瓶。只能使用 1075mm 的發(fā)酵管。測(cè)試產(chǎn)生的氣體時(shí)，發(fā)酵管內(nèi)應(yīng)倒置放人一支小管瓶，其尺寸應(yīng)適宜，確保能布滿培育基，并至少能局部地浸入發(fā)酵管。接種裝。使用由 22 號(hào)或 24 號(hào)鎳合金(鉻鎳、鎳鉻或與之相當(dāng)?shù)暮辖?或鉑銥合金制作金屬絲接種環(huán)，便于火焰滅菌。也可以使用一次性鋁制或不銹鋼制移菌環(huán)。接種環(huán)的直徑至少應(yīng)為 3mm。用干熱法或蒸汽滅菌。也可以使用一次性硬木制點(diǎn)樣器，其直徑應(yīng)為 0.20.3cm，至少比發(fā)酵管長(zhǎng) 2.5cm，經(jīng)干熱滅茵后貯存在玻璃或其它無(wú)毒容器內(nèi)。試劑 IA

11、STM型水ASTM D1193。應(yīng)測(cè)定水中的雜志。l緩沖水。貯備磷酸鹽緩沖液的制備：溶解 34.0g 磷酸二氫鉀(KH P0 )于 500ml24型水中,用 1N 氫氧化鈉溶液(NaOH)調(diào)至 pH7.20.5,再用型水稀釋至l L。將1.25ml 貯備磷酸鹽緩沖液和5.0ml 氯化鎂溶液(38g MgCl L型水或81.1g2MgCl 6H 0LII 型水)參加 1LII 型水。分成數(shù)份，使每份的體積在高壓滅菌 15min 后為22992.0 或 90.2m1。胨水：制備 10胨在型水中的溶液。稀釋肯定體積的胨水溶液，使最終的溶液為 0.1。最終的pH 應(yīng)為 6.8。將胨水分成數(shù)份，使每份的

12、體積在高壓滅菌15min 后為 992.0 或 90.2m1。不要讓細(xì)菌于室溫下在任何一種稀釋水中懸浮30min 以上，否則有些菌種會(huì)死亡，有些菌種會(huì)增殖。月桂酰胰蛋白液態(tài)培育基。液態(tài)培育基的成分為：胰蛋白：20.Og；乳糖：5.Og；磷酸氫二鉀(K HP0 )：2.75g；24磷酸二氫鉀(KH P0 )：2.75g；氯化鈉：5.0g；月桂酰硫酸鈉：O.1g；型水 1L。也可買(mǎi)到24包裝好的干粉狀月桂酰胰蛋白液態(tài)培育基。要使月桂酰胰蛋白液態(tài)培育基的濃度在參加lOOml 或 lOml 份量的水樣到培育基內(nèi)時(shí)。各養(yǎng)分成分的濃度不至降低到低于標(biāo)準(zhǔn)培育基的濃度。按表 5-8 配制這種培育萊。表 5-8

13、 月桂酰胰蛋白液態(tài)培育基的配制接種水樣ml試管內(nèi)培育基的量ml培育基+接種的總體積ml所需脫水的月桂酰胰 蛋白液態(tài)培育基的濃度g/L110 或稍多11 或稍多35.610102071.210203053.410050150106.810035135137.110020120213.6將液態(tài)培育基分裝到放置有倒置小管瓶的發(fā)酵試管中，培育基的量要足夠多，使得滅菌后能至少局部漂浮倒置的小管瓶。于 121滅菌 1215min。滅菌后pH 應(yīng) 6.80.2。亮綠乳糖膽汁液態(tài)培育基。液態(tài)培育基的成分為：胨 10.Og；乳糖：l0.Og；牛膽：20.Og；亮綠：0.0133g； 型水：1L。也可買(mǎi)到包裝好的

14、干粉狀液態(tài)培育基。將液態(tài)培育基分裝到放置有倒置小管瓶的發(fā)酵試管中。培育基的量要足夠多，使得滅菌后能至少局部漂浮倒置的小管瓶。于121滅菌 1215min。滅菌后pH 應(yīng)為 7.20.2。草酸銨-結(jié)晶紫赫克氏所用的。溶解 2g 結(jié)晶紫燃料含量 90%于 20ml95%的乙醇中；溶解 0.8gNH C O H O 于 80ml型水中；將兩種溶液混合，使用前放42 2 42置 24h，然后通過(guò)濾紙濾入染色劑瓶中。魯格氏Lugol)溶液。經(jīng)革蘭氏改性。將 1g 結(jié)晶碘和 2gKI 置于缽中研磨。每次加幾毫升型水，每次加水后徹底研磨，直到完全成為溶液為止。用剩余的水前后總共用 300ml將溶液洗入棕色玻

15、璃瓶?jī)?nèi)。復(fù)染劑。溶解 2.5 克藏紅染料于 100ml95%的乙醇與丙酮混合。丙酮酒精。將等體積的 95%乙醇與丙酮混合。革蘭染色劑包?？梢允褂檬惺鄹锾m染色劑包代替第 5.5、5.6、5.7 和 5.8節(jié)中的試劑。樣品的采集、保存和處理全部水樣都必需依據(jù)采樣打算其中包括美國(guó)環(huán)境保護(hù)局 1978 年議定的留意事項(xiàng)采集。用適宜的洗滌劑和熱水徹底清洗全部玻璃器皿，然后用熱水沖洗以除去殘留的痕量洗滌劑，最終用型水沖洗。假設(shè)使用機(jī)械式玻璃器皿洗滌機(jī)，其進(jìn)水管件應(yīng)為不銹銅或其它無(wú)毒材料的。不得使用銅管安排型水。沖洗水系統(tǒng)要承受不銹銅或其它無(wú)毒材料。將玻璃器皿不包括盛放在金屬容器內(nèi)的器皿于 170滅菌至少

16、60min； 假設(shè)依據(jù)自記溫度計(jì)滅菌室內(nèi)溫度是均勻的，可以于 160滅菌。盛放在金屬容器內(nèi)的玻璃器皿應(yīng)于 170滅菌至少 2h。按上述方法對(duì)非塑料制水瓶滅菌，也可于 121蒸壓滅菌 15min。每批取一瓶做無(wú)菌性檢驗(yàn)。假設(shè)預(yù)備采集含有余氯和其它鹵素的水樣，清潔的樣品瓶在滅菌前應(yīng)參加足量的 Na S 0 ，使樣品中的濃度約為 100mgL。一個(gè) 120ml 的瓶子，要加 0.1ml 102 2 3的 Na S 0 溶液(這樣就能中和余氯濃度約為 15mgL 的樣品)。塞上瓶塞，加蓋，按2 2 3前述方法用干熱或濕熱滅菌。采集含有高濃度銅或鋅的水樣，或含有高濃度重金屬的廢水時(shí)，水樣瓶?jī)?nèi)內(nèi)應(yīng)先放人能

17、削減金屬毒性的螯合劑。當(dāng)這類(lèi)樣品要轉(zhuǎn)運(yùn) 4h 以上時(shí)。這一點(diǎn)尤其重要。用 372mgL 的乙二胺四醋酸四鈉鹽(EDTA)作螯合劑，使用前將 EDTA 溶液調(diào)至pH6.5?？蓪?EDTA 分別參加水樣瓶?jī)?nèi)(向 120ml 的瓶口參加 0.3ml 15的溶液)，然后滅菌；也可先與 Na S 0 溶液混合，然后參加瓶中。12 2 3采集水樣時(shí)，要在瓶?jī)?nèi)留有足夠的空間至少 2.5cm 高，以備檢驗(yàn)前振蕩混合。留神采集水樣，使之能夠代表預(yù)備檢驗(yàn)脈墻要防止的水，還要防止采樣時(shí)或檢驗(yàn)前的一段時(shí)間內(nèi)水樣受到污染。水樣瓶在采樣前始終要密封。瓶塞和罩蓋或螺帽要做為一體取下，留神避開(kāi)弄臟。采水時(shí)不要握著瓶塞、蓋帽和

18、瓶頸，要保護(hù)這些局部不受污染。握住瓶子靠底部的部位，讓水灌入。，不要用水沖洗。馬上塞好瓶塞或蓋好瓶蓋，沿瓶頸將罩蓋栓緊。步驟假定試驗(yàn)。用適當(dāng)?shù)睦圻M(jìn)量(1ml 的倍數(shù)或約數(shù))水樣接種到一系列發(fā)酵試管(“初步”發(fā)酵試管)。留意確保培育基和參加的樣品混合物中養(yǎng)分成分的濃度符合第 5.3 節(jié)提出的要求。用無(wú)菌吸管從開(kāi)頭的水樣瓶以及其次連續(xù)的各稀釋瓶依次做轉(zhuǎn)移。假設(shè)吸管在完成轉(zhuǎn)移之前受到污染，則應(yīng)換用另一支無(wú)菌吸管。從每一個(gè)不同的稀釋水樣做轉(zhuǎn)移時(shí)， 要使用一支不同的無(wú)菌吸管。不要在陽(yáng)光直射下做稀釋。從吸管筒中取出無(wú)菌吸管時(shí)要留神操作；為了避開(kāi)污染，勿使吸管尖在被拉出來(lái)時(shí)遇到露在筒外的其它吸管的頭，也勿使

19、吸管尖觸碰稀釋瓶的瓶嘴和瓶頸。吸取水樣時(shí)，吸管尖插入水樣或稀釋樣液面下不要超過(guò) 2.5cm。當(dāng)放出肯定量的水樣時(shí)，握住吸管使管尖成45角接觸試管頸內(nèi)側(cè)。接種于月桂酰胰蛋白液態(tài)培育基發(fā)酵試管的水樣，其份量和接種數(shù)目因被檢驗(yàn)水體的特性而有所不同，不過(guò)一般是使用Iml 的十進(jìn)倍數(shù)或約數(shù)來(lái)稀釋水樣。參加水樣后，振動(dòng)試管架充分混合。不要讓試管翻倒。發(fā)酵試管經(jīng)接種后于 350.5培育。242h 后，輕輕搖蕩每支試管.，并做檢查，假設(shè)沒(méi)有氣體生成并被截留在倒置的小管瓶?jī)?nèi)，則應(yīng)連續(xù)培育，在第 483h 再行檢查。記錄每支試管內(nèi)有無(wú)氣體生成，氣體量則可不管。假設(shè)在 483h 之內(nèi)，在內(nèi)部的發(fā)酵試管或小管瓶?jī)?nèi)生成

20、了任何量的氣體，便可斷定為陽(yáng)性假定試驗(yàn)。試管清楚而里面有空氣泡時(shí)，不行與真正生成的氣體混淆。氣體假設(shè)是由發(fā)酵產(chǎn)生的，液態(tài)培育基會(huì)變混濁。假設(shè)輕輕振蕩發(fā)酵試管，有小氣泡不斷消滅在小管瓶外部的整個(gè)培育基中，這就表示發(fā)酵活潑。在 483h 的培育完畢時(shí)仍無(wú)氣泡生成，則說(shuō)明試驗(yàn)結(jié)果為陰性。觀看 48h 的人為限制，自然沒(méi)有考慮到那些產(chǎn)生氣體格外緩慢，一般對(duì)環(huán)境衛(wèi)生影響有限而又不常見(jiàn)的大腸桿菌類(lèi)細(xì)菌。確信試驗(yàn)。但凡在 24h 培育期內(nèi)顯示有任何量氣體產(chǎn)生的初步發(fā)酵度管，均應(yīng)做確信試驗(yàn)。假設(shè)不到 24h 初步發(fā)酵度管內(nèi)就已顯示出活潑的發(fā)酵，則應(yīng)準(zhǔn)時(shí)轉(zhuǎn)移到確信試驗(yàn)的培育基中，不必等到24h 完畢時(shí)再轉(zhuǎn)移。假

21、設(shè)在48h 培育期完畢時(shí)，又有初步發(fā)酵試管顯示有氣體產(chǎn)生，這些試管亦應(yīng)做確信試驗(yàn)。把顯示有氣體產(chǎn)生的初步發(fā)酵試管輕輕振蕩或轉(zhuǎn)動(dòng)，然后：(a)取一支環(huán)徑為 3mm 的無(wú)菌金屬接種環(huán)，轉(zhuǎn)移一個(gè)全環(huán)的培育到含有亮綠乳糖膽汁液態(tài)培育基的發(fā)酵試管中；或者(b)，將一支無(wú)菌木涂棒插入初步培育中至少 2.5cm 深，馬上取出，再將其插入盛有亮綠乳糖膽汁液態(tài)培育基的發(fā)酵試管底部，取出后棄去。將接種后的亮綠乳糖膽汁液態(tài)培育基試管于 350.5培育 483h。在這段時(shí)間內(nèi)任何時(shí)刻，假設(shè)在亮綠乳糖膽汁液態(tài)培育基發(fā)酵試管的倒置小管瓶?jī)?nèi)有氣體產(chǎn)生，不管氣體量多寡，均可斷定為陽(yáng)性確信試驗(yàn)。完成試驗(yàn).取確信試驗(yàn)呈陽(yáng)性的試管

22、，做完成試驗(yàn)，以明確證明大腸桿菌類(lèi)細(xì)菌的存在， 并對(duì)全部被分析樣品的 20供給質(zhì)量把握數(shù)據(jù)。每一支產(chǎn)生了氣體的亮綠乳糖膽汁液態(tài)培育基試管，在消滅氣體后要盡快轉(zhuǎn)移畫(huà)線到一個(gè)或數(shù)個(gè)依紅亞甲藍(lán)平皿內(nèi)。在平皿瓊脂上畫(huà)線時(shí)要確保分別長(zhǎng)出的一些菌落，至少褶隔 0.5cm。畫(huà)線時(shí)要遵循下述留意事項(xiàng)，以求在確實(shí)存在大腸桿菌時(shí)能獲得高數(shù)量成功的分別菌落：(a)使用尖端稍彎曲的接種針；(b)先輕擊發(fā)酵試管并使之傾斜，以避開(kāi)接種針上取到任何膜狀物或浮渣；(c)針尖要插入試管液體內(nèi)大約 5.0mm 深；(d) 在平皿上畫(huà)線時(shí)，要用針尖的彎曲局部接觸瓊脂，避開(kāi)刮傷或戳破培育基外表。7.3.3 倒置培育皿，于 350.5

23、12 培育 242h。在依紅亞甲藍(lán)瓊脂培育基上生長(zhǎng)出來(lái)的菌落，分別有典型的(即有菌落核心， 具有或沒(méi)有金屬光澤)、非典型的(即不透亮，無(wú)菌落核心、粘狀、培育 24h 后呈粉紅色) 和陰性的(全部其它的)。從每個(gè)平皿上挑取 1 個(gè)或數(shù)個(gè)典型的、分別完全的大腸桿菌菌落；假設(shè)不存在典型菌落，就挑取 2 個(gè)或多個(gè)被認(rèn)為最可能含有大腸桿菌類(lèi)細(xì)菌的其它菌落，分別轉(zhuǎn)移到月桂酰胰蛋白液態(tài)培育基發(fā)酵試管和養(yǎng)分瓊脂斜面上。注：在轉(zhuǎn)移茵落時(shí)，應(yīng)盡可能選取分別完全的菌落。并用經(jīng)過(guò)火焰滅菌和空氣冷卻過(guò)的轉(zhuǎn)移針略微觸碰菌落外表。這樣可以盡量削減轉(zhuǎn)移混合細(xì)菌的可能性.。將其次次使用的液態(tài)培育基(即月桂酰胰蛋白液態(tài)培育基一譯

24、注)試管于350.512 培育 242h；假設(shè)在這段時(shí)問(wèn)內(nèi)沒(méi)有產(chǎn)生氣體，則連續(xù)培育，在第 483h 再次檢查。對(duì)于顯示有氣體產(chǎn)生的液態(tài)培育基試管，取其相應(yīng)的24h 瓊脂斜面培育，做革蘭氏染色(見(jiàn)第 7.4 節(jié))，在顯微鏡底下觀看。在其次次的月桂酰胰蛋白液態(tài)培育基試管中在483h 內(nèi)產(chǎn)生氣體，并且在瓊脂培育基上被證明為革蘭氏陰性、不形成孢子的桿狀細(xì)菌，則可以認(rèn)為完成試驗(yàn)令人滿足，并確認(rèn)了存在著大腸桿菌類(lèi)細(xì)菌。革蘭氏染色步驟。在玻璃載片上滴 1 滴型水，從瓊脂斜面上取 1 點(diǎn)細(xì)菌培育，在水滴上調(diào)成淡的乳液。在空氣中晾干或者將載玻片穿過(guò)火焰使之固定，然后用草酸銨一結(jié)晶紫溶液染色 1min。再用自來(lái)水

25、沖洗載玻片；繼而用魯哥溶液處理1 min。(有關(guān)試劑見(jiàn)第 5.55.8 節(jié))。把染色后的載玻片放在自來(lái)水下沖洗，然后將載玻片夾在手指中問(wèn)，讓丙酮酒精順著載玻片流下，直到不再有染色被洗掉為止。這樣脫色處理約1530 s，不要脫色過(guò)度。接著用藏紅復(fù)染15 s，然后用自來(lái)水沖洗，用吸水紙吸干，最終在顯微鏡底下觀看。被脫了色的，而且能承受藏紅染色的細(xì)胞呈粉紅色，被規(guī)定為具有革蘭氏陰性反響。沒(méi)被脫色、仍保持結(jié)晶紫染色的細(xì)胞呈深藍(lán)色，被規(guī)定為革蘭氏陽(yáng)性。MPN 的計(jì)算和記錄。依據(jù)每一種稀釋度確實(shí)信試驗(yàn)或完成試驗(yàn)中的陽(yáng)性試管數(shù)目，可以由MPN 表獲得樣品中大腸桿菌類(lèi)細(xì)菌的計(jì)算密度。表 5-9 示出了飲用水檢

26、驗(yàn)的MPN 指數(shù)和 95的置信限，表 5-10 示出了一般應(yīng)用時(shí)的MPN 指數(shù)和 95的置信限。為了確定MPN 指數(shù)，需要稀釋 3 個(gè)。例如(參見(jiàn)表 510)，假設(shè)用 5 個(gè) 10ml； 5 個(gè) 1.0ml 和 5 個(gè) 0.1ml 份量的水樣作接種物，其中有 4 個(gè) 10ml；2 個(gè) Iml 和 0 個(gè) 0.Iml 份量的接種水樣給出陽(yáng)性結(jié)果，則編碼結(jié)果為 4-2-0，MPN 指數(shù)為 22100m1。表 5-9 使用 5 個(gè) lOml 的份量做檢驗(yàn)時(shí).各種陽(yáng)性 和陰性結(jié)果的組合所應(yīng)有的MPN 指數(shù)和 95的置信限每支試管參加 10ml 水樣，從 5MPN 指數(shù)/100ml95%置信限支試管所得

27、的陽(yáng)性反響試管數(shù)下限上限0168.0無(wú)限假設(shè)一系列 10 進(jìn)制稀釋不是 1O、1 和 0.1ml，或者假設(shè)此系列中承受的樣品體積超過(guò) 3 個(gè)。則應(yīng)遵循本章參考文獻(xiàn)中規(guī)定的細(xì)菌密度測(cè)定步驟。報(bào)告水樣的MPN 數(shù)值時(shí)，一律以 100ml 水樣為根底。質(zhì)量把握在環(huán)境監(jiān)測(cè)的微生物學(xué)方法一書(shū)(美國(guó)環(huán)境保護(hù)局，1978，)中的第局部， 對(duì)質(zhì)量把握程序做了具體表達(dá)，試驗(yàn)中應(yīng)隨時(shí)嚴(yán)格遵守這些程序。處理和貯存樣品時(shí)應(yīng)留神從事，盡可能使其保持原來(lái)的狀態(tài)。應(yīng)認(rèn)真選擇采樣點(diǎn)和采樣頻率，以便能夠獲得代表該點(diǎn)水質(zhì)特性和變化性的數(shù)據(jù)。水樣應(yīng)準(zhǔn)時(shí)分析。不能準(zhǔn)時(shí)分析時(shí)，水樣應(yīng)于l4冷藏并在 6h 之內(nèi)予以分析。培育基的質(zhì)量把握對(duì)于微生物學(xué)分析的有效性至關(guān)重要。下面簡(jiǎn)潔介紹一些需要考慮的重要因素。訂購(gòu)僅夠 1 年使用的培育基，首先使用貯備時(shí)問(wèn)最