臨床免疫學(xué)檢驗：化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)

1、化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）（enzyme-linked immunosorbent assay）酶聯(lián)免疫吸附試驗（ELISA）（enzyme-linked immunosorbent assay）化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA）（ chemiluminescence immunoassay）技術(shù)要點抗原抗體反應(yīng)雙抗體夾心法雙抗原夾心法間接法競爭法標(biāo)記免疫復(fù)合物（B）和游離標(biāo)記物（F）分離顯色（光強(qiáng)度的檢測）標(biāo)準(zhǔn)曲線制作和標(biāo)本結(jié)果計算化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)（chemiluminescence immunoassay techniques) 是將化學(xué)發(fā)光與免疫反應(yīng)相結(jié)合，用于檢測

2、微量抗原或抗體的一種新型標(biāo)記免疫分析技術(shù)。 特點：特異性高、敏感性高、分離簡便、快速、試劑無毒、安全穩(wěn)定、 可自動化發(fā)光（luminescence) 一種物質(zhì)由電子激發(fā)態(tài)回復(fù)到基態(tài)時，釋放出的能量表現(xiàn)為光的發(fā)射。光照發(fā)光（photoluminescence) 生物發(fā)光（bioluminescence)化學(xué)發(fā)光（chemiluminescence)第一節(jié) 概述光照發(fā)光（photoluminescence) 發(fā)光劑經(jīng)短波長入射后進(jìn)入激發(fā)態(tài)，當(dāng)回復(fù)至基態(tài)時發(fā)出較長波長的可見光。生物發(fā)光（bioluminescence) 熒光素在熒光素酶的催化下，利用ATP能，生成激發(fā)態(tài)氧化熒光素，在回復(fù)基態(tài)時多余的

3、能量以光子釋放出的光?；瘜W(xué)激發(fā)（足夠能量170-300kj/mol)發(fā)光化學(xué)發(fā)光（chemiluminescence) 物質(zhì)在化學(xué)反應(yīng)過程中，其物質(zhì)分子吸收化學(xué)能產(chǎn)生的光的輻射現(xiàn)象。化學(xué)反應(yīng)產(chǎn)生的能量 產(chǎn)物分子（或中間態(tài)分子）呈激發(fā)態(tài) 發(fā)射光子 衰退到基態(tài) （釋放能量）化學(xué)發(fā)光效率（或量子產(chǎn)率）（CL）決定于生成激發(fā)態(tài)產(chǎn)物分子的化學(xué)激發(fā)效率（CE） 激發(fā)態(tài)分子的發(fā)射效率（EM）化學(xué)發(fā)光效率越高，檢測的靈敏度越高?；瘜W(xué)發(fā)光劑（chemiluminescence reagent) 在化學(xué)反應(yīng)中參與能量轉(zhuǎn)移并最終以發(fā)射光子的形式釋放能量的化合物。酶促反應(yīng)的發(fā)光劑 直接化學(xué)發(fā)光劑電化學(xué)發(fā)光劑第二節(jié) 化

4、學(xué)發(fā)光劑與標(biāo)記技術(shù)能作為化學(xué)發(fā)光劑的條件：發(fā)光的量子產(chǎn)率高；它的物理-化學(xué)特性要與被標(biāo)記或測定的物質(zhì)相 匹配；能與抗原或抗體形成穩(wěn)定的偶聯(lián)結(jié)合物； 其化學(xué)發(fā)光常是氧化還原反應(yīng)的結(jié)果；在所使用的濃度范圍內(nèi)對生物體沒有毒性。偶聯(lián)后仍保留高的量子效應(yīng)和反應(yīng)動力；應(yīng)不改變或極少改變被標(biāo)記物的理化特性， 特別是免疫活性。保證在可見光范圍內(nèi)觀察到發(fā)光酶促反應(yīng)的發(fā)光劑 經(jīng)酶的降解作用而發(fā)出光的一類發(fā)光劑。HRP的發(fā)光劑魯米諾或其衍生物對-羥基苯乙酸ALP的發(fā)光底物AMPPD4-MUPHRP的發(fā)光劑 1、魯米諾(luminol)或其衍生物pH8.6425nmHRP的發(fā)光劑 2、對-羥基苯乙酸(HPA)HPA+

5、 H2O2 氧化二聚體（熒光物質(zhì)） 450 nm波長熒光 HRP350nm激發(fā)ALP的發(fā)光劑 1、AMPPD（金剛烷）470nm穩(wěn)定不穩(wěn)定ALP的發(fā)光劑 2、4-MUP4-MUP ALP 4-MU 448nm熒光360nm直接化學(xué)發(fā)光劑 不需酶的催化作用，只需改變?nèi)芤旱膒H等條件就能發(fā)光的一類發(fā)光劑。吖啶酯（acridinium ester,AE 直接標(biāo)記 470nm ）電化學(xué)發(fā)光劑 通過在電極表面進(jìn)行電化學(xué)反應(yīng)而發(fā)出光的物質(zhì)。三聯(lián)吡啶釕電化學(xué)發(fā)光劑反應(yīng)原理陽極強(qiáng)還原劑強(qiáng)氧化劑三丙胺三聯(lián)吡啶釕化學(xué)發(fā)光劑標(biāo)記物的制備 化學(xué)發(fā)光劑標(biāo)記物是將化學(xué)發(fā)光劑與抗體或抗原結(jié)合在一起的復(fù)合物。 標(biāo)記方法多利用

6、交聯(lián)劑使化學(xué)發(fā)光劑與被標(biāo)記物分子結(jié)構(gòu)中游離的氨基、羧基、硫氫基、羥基等基團(tuán)形成不可逆連接。碳二亞胺（EDC）縮合法 （蛋白質(zhì)中游離羧基與發(fā)光分子中的氨基形成穩(wěn)定的酰胺鍵）過碘酸鈉氧化法 （標(biāo)記的糖蛋白穩(wěn)定性好。凡含有芳香伯胺和脂肪伯胺的發(fā)光劑可用此法標(biāo)記。無糖基的蛋白不適用）重氮鹽偶聯(lián)法（簡易，成本低，重復(fù)性好。無芳香伯氨的不適用）N-羥基琥珀酰亞胺活化法 （吖啶酯類多用此法標(biāo)記）影響標(biāo)記的因素發(fā)光劑被標(biāo)記蛋白質(zhì)的性質(zhì) 標(biāo)記方法原料比 標(biāo)記率 溫度 純化與保存 純化的結(jié)合物應(yīng)及時測定蛋白質(zhì)的含量、免疫活性及發(fā)光效率?；瘜W(xué)發(fā)光酶免疫分析: 用酶標(biāo)記抗原或抗體，免疫反應(yīng)后，酶催化發(fā)光底物，引發(fā)發(fā)光

7、。（直接）化學(xué)發(fā)光免疫分析: 化學(xué)發(fā)光物質(zhì)直接標(biāo)記抗原或抗體，免疫反應(yīng)后引發(fā)化學(xué)發(fā)光。 電化學(xué)發(fā)光免疫分析： 電化學(xué)發(fā)光劑標(biāo)記抗原或抗體，免疫反應(yīng)后引發(fā)電化學(xué)發(fā)光。第三節(jié) 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的類型化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的分類標(biāo)記物底物原理檢測信號均相/非均相推出年代堿性磷酸酶金剛烷LEIA光強(qiáng)度非均相19904-MUPLEIA光強(qiáng)度非均相1992辣根過氧化物酶魯米諾LEIA光強(qiáng)度非均相1989吖啶酯無CLIA光強(qiáng)度非均相1990三聯(lián)吡啶釕無ECL電激發(fā)強(qiáng)度非均相1990原理技術(shù)要點 抗原抗體反應(yīng) 標(biāo)記物游離部分和結(jié)合部分分離 發(fā)光反應(yīng)及檢測 方法學(xué)評價第三節(jié) 化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的類型一、發(fā)光酶免

8、疫分析原理 屬于酶免疫測定的一種。只是最后一步酶反應(yīng)所用底物為發(fā)光劑，通過發(fā)光反應(yīng)發(fā)出的光在特定的儀器上進(jìn)行測定。技術(shù)類型 根據(jù)酶促反應(yīng)底物不同可分為：熒光酶免疫測定技術(shù) 化學(xué)發(fā)光酶免疫測定技術(shù) 根據(jù)免疫學(xué)反應(yīng)模式可分為:雙抗體夾心法雙抗原夾心法固相抗原競爭法原理（ALP標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖 ）470nm原理（ALP標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖 ） 洗滌棄上清原理（HRP標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖 ）技術(shù)要點抗原抗體反應(yīng)雙抗體夾心法雙抗原夾心法固相抗原競爭法酶標(biāo)記免疫復(fù)合物（B）和游離酶標(biāo)記物（F）分離磁顆粒分離法微粒子捕獲法包被珠分離法技術(shù)要點酶促發(fā)光反應(yīng)ALP法標(biāo)準(zhǔn)曲線制作和標(biāo)本結(jié)果計

9、算試劑校準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線的發(fā)光量值質(zhì)控品驗證校準(zhǔn)曲線的有效性根據(jù)標(biāo)本的發(fā)光量值自動計算待測物的含量方法學(xué)評價靈敏度高酶和發(fā)光兩級放大發(fā)光增強(qiáng)劑影響因素非特異性吸附洗滌不夠徹底可因其他來源的過氧化物酶類物質(zhì)產(chǎn)生非特異性酶發(fā)光反應(yīng)標(biāo)本中含影響標(biāo)記酶活性的物質(zhì)二、化學(xué)發(fā)光免疫分析原理（吖啶酯標(biāo)記化學(xué)發(fā)光免疫分析示意圖 ）技術(shù)要點抗原抗體反應(yīng)雙抗體夾心法雙抗原夾心法間接法競爭法酶標(biāo)記免疫復(fù)合物（B）和游離酶標(biāo)記物（F）分離磁顆粒分離法技術(shù)要點發(fā)光反應(yīng)加入氧化劑（H2O2）加pH糾正液（NaOH）使呈堿性吖啶酯分解發(fā)光標(biāo)準(zhǔn)曲線制作和標(biāo)本結(jié)果計算試劑校準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線的發(fā)光量值質(zhì)控品驗證校準(zhǔn)曲線的有效性根據(jù)標(biāo)本的

10、發(fā)光量值自動計算待測物的含量方法學(xué)評價發(fā)光噪音低，反應(yīng)簡單、快速直接標(biāo)記，結(jié)合穩(wěn)定，不影響標(biāo)記物的生物學(xué)活性和理化特性固相磁粉包被面積大，清洗分離簡便、快捷瞬間發(fā)光對檢測儀的靈敏度要求高特定項目試劑檢測試劑含以下組分：a、三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記的抗體b、生物素化合的抗體c、鏈霉親和素（SA）磁性微粒d、三丙胺（TPA）溶液e、洗滌液 三、電化學(xué)發(fā)光免疫分析原理： 電化學(xué)發(fā)光免疫測定(Electro Chemiluminescence ImmunoAssay，ECLIA）系統(tǒng)試劑步驟一 在孵育杯中加試劑三聯(lián)吡啶釕標(biāo)記的抗體、生物素化合的抗體及待測標(biāo)本（含抗原） 反應(yīng)在液相中進(jìn)行，37下9分鐘完成步驟二

11、在上述反應(yīng)液中加入試劑SA磁性微粒 反應(yīng)在接近液相的條件中進(jìn)行，37下9分鐘完成步驟三 光子檢測 反應(yīng)液輸入測量池，由于磁鐵吸引，磁性微粒被吸著在電極上，其余反應(yīng)物游離在測量池，完成游離的和結(jié)合的標(biāo)記抗體的分離。TPA溶液送入測量池，將殘余的游離標(biāo)記抗體排出測量池，在測量池中充滿TPA溶液。電極上通電，三聯(lián)吡啶釕與TPA發(fā)生電化學(xué)發(fā)光反應(yīng)，發(fā)出的光被光電倍增管收集，測定光強(qiáng)度。 最后，終止電壓，移開磁珠，加入清洗液沖洗流動測量室，準(zhǔn)備下一個樣品測定。技術(shù)要點抗原抗體反應(yīng)雙抗體夾心法雙抗原夾心法間接法競爭法酶標(biāo)記免疫復(fù)合物（B）和游離酶標(biāo)記物（F）分離磁顆粒分離法技術(shù)要點發(fā)光反應(yīng)加三丙胺的緩沖液

12、，電極加壓，啟動ECL反應(yīng)標(biāo)準(zhǔn)曲線制作和標(biāo)本結(jié)果計算試劑校準(zhǔn)：標(biāo)準(zhǔn)曲線的發(fā)光量值質(zhì)控品驗證校準(zhǔn)曲線的有效性根據(jù)標(biāo)本的發(fā)光量值自動計算待測物的含量方法學(xué)評價持續(xù)時間長，信號強(qiáng)度強(qiáng)，易測定、控制直接標(biāo)記，結(jié)合穩(wěn)定，不影響標(biāo)記物的生物學(xué)活性和理化特性靈敏度高、線性范圍寬、反應(yīng)時間短第四節(jié) 化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的應(yīng)用檢測項目甲狀腺激素: T3、T4、 FT3、FT4、TSH、TGAb、 TPOAb生殖激素：-HCG、FE3、AFP、 PRL、FSH、LH、 PGN、E2、TES腎上腺和垂體激素：ALD、COR、GH、PTH、ACTH貧血因子：VitB12、FOLATE、FER腫瘤標(biāo)志物：AFP、CEA、P

13、SA、fPSA、CA19-9、 CA12-5、CA15-3、 CA72-4第四節(jié) 化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)的應(yīng)用檢測項目感染性疾?。阂略w、弓形蟲、風(fēng)疹病毒、巨細(xì)胞病毒糖尿?。篒NS、C-P心血管系統(tǒng)：CK、CK-MB、MB、CTNI、BNP、MYO病毒標(biāo)志物：HBV、HIV、HCV等骨代謝：骨膠原酶、脫氧吡啶啉過敏性疾?。篒gE治療藥物:茶堿、地高辛、環(huán)孢素、巴比妥、苯妥英鈉、 丙戊酸、卡馬西平唐氏綜合征唐氏綜合征是一種新生兒最常見的常染色體異常疾病，發(fā)病率大約為1：800。唐氏篩查 孕早期（7周-14周）：PAPP-A、 游離-HCG 孕中期（14周+1-21周)：AFP、-HCG、FE312孕周

14、16孕周唐氏綜合征風(fēng)險評估統(tǒng)計的專門算法多項生化標(biāo)志物檢查母親年齡、準(zhǔn)確的孕周頸部半透明厚度（孕早期）對篩查對象的血清檢測結(jié)果和對應(yīng)孕周的中位值進(jìn)行比較，以中位值倍數(shù)（MoM）表示PRISCA能夠計算下面多種不同的風(fēng)險：年齡風(fēng)險21三體綜合征血清生化標(biāo)志物風(fēng)險18三體綜合征血清生化標(biāo)志物風(fēng)險頸部半透明厚度血清生化標(biāo)志物21三體綜合征相結(jié)合的風(fēng)險神經(jīng)管缺陷風(fēng)險(必須檢測AFP， AFP只能在孕中期檢測到，孕早期不能計算神經(jīng)管缺陷風(fēng)險)報告格式及內(nèi)容：1、孕周2、AFP、 FE3、 -HCG（孕中期） 3、游離-HCG、PAPP-A（孕早期）4、18三體風(fēng)險（孕早期、孕中期）5、21三體風(fēng)險（孕早

15、期、孕中期）6、神經(jīng)管缺陷風(fēng)險（孕中期）7、風(fēng)險評估8、建議高風(fēng)險孕婦的進(jìn)一步檢查 唯一的染色體異常產(chǎn)前實驗診斷是通過像羊水穿刺或絨毛取樣（CVS）等侵襲性手段作胎細(xì)胞的細(xì)胞遺傳（染色體核型分析）檢查。 產(chǎn)前診斷時間 1早孕絨毛采樣檢查宜在孕8周11周進(jìn)行。 2羊水穿刺檢查宜在孕16周21周進(jìn)行。 3臍血管穿刺檢查宜在孕18周24周進(jìn)行。 相對于用藥劑量，血藥濃度與療效間有更好的相關(guān)性血藥濃度監(jiān)測的選擇標(biāo)準(zhǔn)嚴(yán)重毒性及相當(dāng)不明確的臨床最終治療效果陡直的劑量-反應(yīng)曲線狹窄的治療范圍長期治療威脅生命的疾病藥物動力學(xué)上存在明顯的個體差異非線性藥物動力學(xué)經(jīng)常服用的藥物可靠的檢測方法血藥濃度監(jiān)測的指征懷疑治療藥物過量治療無效監(jiān)測病人是否依照處方服藥確定藥物的劑量一般藥物監(jiān)測的采血時間： 用