二重實(shí)時(shí)PCR快速檢測(cè)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌

1、二重實(shí)時(shí)PCR快速檢測(cè)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌【關(guān)鍵詞】實(shí)時(shí)聚合酶鏈反響耐甲氧西林金葡菌eA基因nu基因1材料與方法1.1材料(1)菌株來(lái)源2022年9月從安徽省35所醫(yī)院臨床標(biāo)本中無(wú)重復(fù)別離的131株金葡菌和6株凝固酶陰性的表葡菌；標(biāo)準(zhǔn)菌株金葡菌AT33591(RSA)和金葡菌AT29213(SSA)以及大腸埃希菌AT25922、肺炎克雷伯菌AT700603、銅綠假單胞菌AT27853等均由安徽醫(yī)科大學(xué)附屬醫(yī)院感染病科提供。(3)主要儀器ABIPris7500型熒光定量PR儀(美國(guó)AppliedBisystes公司)，多點(diǎn)接種儀(英國(guó)AQSanufaturing公司)。(4)實(shí)時(shí)PR引物nu

2、基因的引物NU1/NU2，eA基因的引物EA1/EA2分別擴(kuò)增RSA的279和222bp片段35。兩種引物對(duì)均委托TaKaRa公司合成(表1)。1.2方法(1)細(xì)菌培養(yǎng)與模板制備將實(shí)驗(yàn)用菌種復(fù)蘇后，分別劃線(xiàn)接種到H瓊脂平板上，35培養(yǎng)24h后，挑取單個(gè)菌落溶于100l滅菌蒸餾水中。菌懸液95水浴15in，7000r/in離心1in，棄沉淀、留上清液作為PR反響的DNA模板。表1nu、eA二重實(shí)時(shí)PR的引物序列(2)nu或eA基因單一引物實(shí)時(shí)PR25l的反響體系中包含有12.5l的SYBRPreixExTaqT(2)、0.5l的RXRefereneDyeII(50)、2l的DNA模板、上游和下游

3、引物各0.2l/L。在ABIPris7500PR儀上經(jīng)95、10s的模板預(yù)變性后，再進(jìn)展40個(gè)循環(huán)的PR擴(kuò)增即95變性5s、60退火和延伸34s。最后一個(gè)循環(huán)的熔解程序?yàn)椋?5，15s；58，1in；95，15s。溫度變化率除了從58升至95這一步為0.1/s，其余均為20/s。熒光信道設(shè)置在F1(530n)處，單點(diǎn)熒光檢測(cè)在每個(gè)循環(huán)的60、34s退火和延伸步驟。(3)nu、eA基因二聯(lián)引物實(shí)時(shí)PR反響總體積為25l，包括：2SYBRPreixExTaqT12.5l，50RXRefereneDyeII0.5l，DNA模板2l，引物NU1、NU2各0.2l/L，引物EA1、EA2各1.0l/L。

4、擴(kuò)增程序與單一引物實(shí)時(shí)PR一樣。每次試驗(yàn)均包括陽(yáng)性對(duì)照(RSA標(biāo)準(zhǔn)菌株)和陰性對(duì)照(模板DNA由無(wú)菌水取代)。(4)數(shù)據(jù)分析反響完畢后，確認(rèn)SYBRGreenI實(shí)時(shí)PR擴(kuò)增曲線(xiàn)和熔解曲線(xiàn)，結(jié)合T(threshldyle，閾循環(huán))值、T(eltingteperature，熔解溫度)值斷定結(jié)果。樣本菌的擴(kuò)增T值35且熒光曲線(xiàn)呈對(duì)數(shù)增長(zhǎng)；T值在RSA標(biāo)準(zhǔn)株的T(eA)0.3范圍之內(nèi)的菌株被認(rèn)為eA基因陽(yáng)性，T值在標(biāo)準(zhǔn)株的T(nu)0.5范圍之內(nèi)的菌株被認(rèn)為nu基因陽(yáng)性。隨機(jī)選取部分野生株的PR產(chǎn)物進(jìn)展3%瓊脂糖凝膠電泳鑒定。(5)特異性試驗(yàn)用于檢測(cè)該二重實(shí)時(shí)PR體系特異性的相關(guān)菌株如前所述。(6)靈

5、敏度試驗(yàn)RSA標(biāo)準(zhǔn)菌純培養(yǎng)增菌后，將上述增菌液各稀釋成100、10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6和10-7等八個(gè)梯度。取一份稀釋液用煮沸法提取核酸作為模板上熒光PR儀；另取一份用來(lái)涂布三個(gè)平板，進(jìn)展平板計(jì)數(shù)。(7)抗生素敏感性試驗(yàn)以AT29213為標(biāo)準(zhǔn)質(zhì)控菌株，按照2022年美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化研究所(LSI)推薦的標(biāo)準(zhǔn)，采用瓊脂平皿對(duì)倍稀釋法測(cè)定頭孢西丁對(duì)金葡菌的最低抑菌濃度(I)。結(jié)果判讀標(biāo)準(zhǔn)6：頭孢西丁的I8g/l為敏感，等于16g/l為中介，32g/l為耐藥。2結(jié)果2.1nu基因、eA基因的檢測(cè)熔解曲線(xiàn)分析說(shuō)明，所有金葡菌在nu基因單一引物實(shí)時(shí)PR中均呈現(xiàn)了T值

6、在80.2081.20之間特異性的峰；所有含eA基因的菌株在eA基因單一引物實(shí)時(shí)PR中均呈現(xiàn)了該基因特異性的峰(T值，78.4078.90)。二重SYBRGreen實(shí)時(shí)PR的熔解曲線(xiàn)分析中所有RSA菌株均呈現(xiàn)了兩個(gè)峰，一個(gè)是eA基因特異性的，另一個(gè)是nu基因特異性的，T值范圍同前；SSA僅有一個(gè)nu基因特異性的峰，RSE僅出現(xiàn)eA基因特異性的峰，SSE沒(méi)有任何特異性的峰出現(xiàn)，與陰性對(duì)照的結(jié)果一樣(圖1)。幾株菌的PR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳鑒定片段大小與預(yù)期的一致。2.2二重實(shí)時(shí)PR的特異性與敏感性應(yīng)用NU1/NU2、EA1/EA2兩對(duì)引物檢測(cè)大腸埃希菌AT25922、肺炎克雷伯菌AT700603

7、、銅綠假單胞菌AT27853，結(jié)果顯示非葡萄球菌菌株無(wú)任何特異擴(kuò)增峰，而陽(yáng)性對(duì)照出現(xiàn)了兩個(gè)特異擴(kuò)增峰。將RSA標(biāo)準(zhǔn)菌株的菌懸液配制成108，107，.，10fu/l濃度，提取DNA后進(jìn)展二重實(shí)時(shí)PR，熔解曲線(xiàn)結(jié)果顯示，eA和nu基因在菌濃2.3RSA的鑒定二重?zé)晒鈱?shí)時(shí)PR對(duì)131株臨床金葡菌野生株的檢測(cè)結(jié)果：nu、eA基因雙陽(yáng)性者為RSA株，僅nu基因陽(yáng)性為SSA株；eA基因有38株陽(yáng)性，陽(yáng)性率為29.01%；nu基因100%陽(yáng)性。6株凝固酶陰性的表葡菌野生株nu基因均為陰性，其中5株eA基因單陽(yáng)性者為RSE，另1株雙陰性者為SSE。nu/eA基因單一引物實(shí)時(shí)PR與二重?zé)晒鈱?shí)時(shí)PR的檢測(cè)結(jié)果一

8、致(表2)。采用瓊脂稀釋法測(cè)定131株臨床別離的金葡菌對(duì)頭孢西丁的耐藥性，其中耐藥40株，中介3株，敏感88株，耐藥率為30.53%(表2)。表2131株金葡菌二重實(shí)時(shí)PR與頭孢西丁I結(jié)果比擬(株數(shù))頭孢西丁I(g/l)32168合計(jì)eA基因陽(yáng)性361138陰性428793合計(jì)403881313討論傳統(tǒng)遺傳學(xué)方法基于RSA的兩個(gè)靶：金葡菌種特異性的基因和編碼PBP2a的eA基因；再結(jié)合PBP2a的免疫學(xué)檢測(cè)被作為標(biāo)準(zhǔn)的RSA確證試驗(yàn)9。但常規(guī)PR操作復(fù)雜、耗時(shí)，后期操作有污染(如電泳、探針雜交、RFLP等來(lái)評(píng)價(jià)擴(kuò)增產(chǎn)物)。熒光實(shí)時(shí)PR在同一密閉的反響管中進(jìn)展擴(kuò)增和檢測(cè)，無(wú)污染、速度快，靈敏度高

9、、特異性強(qiáng)，是替代培養(yǎng)或免疫試驗(yàn)診斷感染性疾病的一個(gè)最正確選擇10。國(guó)外報(bào)道實(shí)時(shí)PR檢測(cè)RSA所用產(chǎn)生熒光的化學(xué)方法有兩種，一種是序列非特異性的，如DNA結(jié)合熒光團(tuán)SYBRGreen5；另一種使用了特異性熒光標(biāo)記的探針，如雜交雙探針11、核酸酶探針12、分子信標(biāo)13。它們除了產(chǎn)生熒光信號(hào)的機(jī)制不同外，檢測(cè)和分析的根本原理相似：即重復(fù)的PR循環(huán)產(chǎn)生了以指數(shù)方式擴(kuò)增的產(chǎn)物以及熒光強(qiáng)度上的一個(gè)相應(yīng)的增加，熒光計(jì)監(jiān)測(cè)報(bào)告熒光信號(hào)的全程變化并由軟件分析結(jié)果。以PR反響的前315個(gè)循環(huán)的熒光信號(hào)作為基線(xiàn)信號(hào)，熒光閾值定義為基線(xiàn)信號(hào)的標(biāo)準(zhǔn)偏向的10倍。擴(kuò)增產(chǎn)物的熒光信號(hào)到達(dá)設(shè)定的閾值時(shí)所經(jīng)過(guò)的擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)為

10、閾循環(huán)(threshldyle，T)。模板DNA量越少，T值越大；假設(shè)T值超出一定的范圍時(shí)，即有可能產(chǎn)生污染，所以觀(guān)察設(shè)定在35個(gè)循環(huán)內(nèi)。SYBRGreenI是一種結(jié)合于所有dsDNA雙螺旋小溝區(qū)域的具有綠色激發(fā)波長(zhǎng)的染料。PR反響完成后，當(dāng)體系溫度從58均勻升至95，PR產(chǎn)物逐漸解鏈，檢測(cè)的熒光值逐步下降。當(dāng)溫度接近T值時(shí)，雙鏈DNA解鏈速度急劇變化，熔解曲線(xiàn)會(huì)在該溫度出現(xiàn)一個(gè)相應(yīng)波峰。DNA分子的T值通常與它的序列組成、G含量、鏈長(zhǎng)度有關(guān)，反響體系中的離子強(qiáng)度、SYBRGreenI濃度等因素也會(huì)影響T值。根據(jù)熔解曲線(xiàn)波峰的多少和狹窄程度，峰頂對(duì)應(yīng)的溫度是否與預(yù)期T一致，確定產(chǎn)物的特異性。在二重實(shí)時(shí)PR體系中，兩種終產(chǎn)物具有不同的T值，分析同一反響物的熒光熔解曲線(xiàn)可區(qū)分nu基因(T，80.2081.20)和eA基因(T，78.4078.90)。該法的檢測(cè)限為102fu/l，特異性試驗(yàn)未見(jiàn)有穿插反響。從臨床樣本中直接檢測(cè)RSA是一個(gè)非常值得關(guān)注的課題。由于Se元件在葡萄球菌屬中分布廣泛(如本次試驗(yàn)中鑒定的5株RSE)，因此從臨床標(biāo)本中直接檢測(cè)RSA很困難。Fang等5組合肉湯增菌和SYBRGreen實(shí)時(shí)PR法建立了一種快速篩檢臨床樣本中RSA的程序，減少了剔除陰性結(jié)果的時(shí)間和精力，這對(duì)RSA流行率低的國(guó)家(如北歐)來(lái)說(shuō)特別有意義。實(shí)時(shí)PR擴(kuò)增RSA中連接SS