低氧反應(yīng)元件調(diào)控缺血心肌轉(zhuǎn)染hVEGF165基因表達(dá)對新生血管的影響

1、低氧反響元件調(diào)控缺血心肌轉(zhuǎn)染hVEGF165基因表達(dá)對新生血管的影響【摘要】目的討論動物整體程度下低氧反響元件(HRE)調(diào)控缺血心肌轉(zhuǎn)染hVEGF165基因表達(dá)對促生血管的影響。方法建立兔心肌缺血動物模型，實驗分為轉(zhuǎn)基因組、缺血對照組、載體對照組和假手術(shù)組。取缺血區(qū)心肌組織，檢測心肌組織HIF-1和hVEGF165表達(dá)，應(yīng)用D31及-SA免疫組化染色測定缺血心肌新生血管密度變化。結(jié)果心肌缺血早期，伴隨內(nèi)源性HIF-1表達(dá)增加，hVEGF165RNA及蛋白表達(dá)相繼升高，缺血46周至頂峰(P0.01)，缺血12周，hVEGF165表達(dá)下調(diào)至缺血前程度。缺血12周，轉(zhuǎn)基因組D31血管密度顯著高于缺血

2、對照組(P0.01)；但是，與缺血前相比，缺血12周，轉(zhuǎn)基因組-SA血管密度顯著低于缺血前程度(P0.01)。結(jié)論HIF-1-HRE對缺血心肌轉(zhuǎn)染hVEGF165表達(dá)發(fā)揮了有效的正相調(diào)控作用，有效地促進缺血心肌毛細(xì)血管生成。但hVEGF165作為促血管生成早期調(diào)節(jié)因子，其促生血管的構(gòu)造尚不完好?！娟P(guān)鍵詞】低氧反響元件；血管內(nèi)皮生長因子；基因調(diào)控;心肌細(xì)胞;缺氧本課題組前期研究結(jié)果說明，在細(xì)胞程度，低氧反響元件HRE對缺血心肌轉(zhuǎn)染hVEGF165基因表達(dá)發(fā)揮了良好的調(diào)控作用1-2。但是，在動物整體程度，HRE對缺血心肌轉(zhuǎn)染hVEGF165基因長期調(diào)控行為對促血管再生的影響尚未說明，本研究旨在動物

3、整體程度，討論在HRE調(diào)控下，缺血心肌轉(zhuǎn)染hVEGF165基因表達(dá)對再生血管生成的影響，為進步缺血心臟hVEGF165基因治療的有效性及平安性提供實驗根據(jù)。1材料和方法1.1病毒包裝及純化pAAV-9H-hVEGF165由美國加利福尼亞大學(xué)Prf.Su惠贈。pAAV-Helper、pAAV-R由北京協(xié)和醫(yī)院提供。病毒包裝由本課題組前期工作完成1。將HEK293T細(xì)胞接種于9平板，10gpAAV-9H-hVEGF165、10gpAAV-R、15gpAAV-Helper、2.5l/Lal2100l與去離子水混合至500l，參加500l2HeBS，混勻后參加HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)皿中，培養(yǎng)23天，將

4、細(xì)胞從培養(yǎng)皿上刮下、離心，參加80l/Lgl2的PBS至細(xì)胞密度為107個/l，參加DNA酶和RNA酶,離心，取上清參加粉劑PEG8000至終濃度10%；冰上置1h，離心，25l/LTris-HlpH8.0溶解沉淀。采用等體積氯仿抽提，離心，回收水相，-20保存、備用。1.2實驗動物成年新西蘭大耳白兔，雌雄不限，體重22.5kg，平均2.30.15kg，共147只。由徐州醫(yī)學(xué)院實驗動物中心提供。1.3實驗方法1.3.1心肌缺血動物模型制備動物硫賁妥鈉靜脈麻醉，正中開胸，顯露心臟。在左冠狀動脈前降支上1/3交界處，6-0無損傷線縫扎，肉眼見結(jié)扎點下方左室前壁心肌漸變青紫、腫脹，同期監(jiān)測EG出現(xiàn)典

5、型心肌缺血改變者，確認(rèn)模型成功。1.3.2實驗動物分組及處理實驗動物隨機分為4組。轉(zhuǎn)基因組A組，n=42：模型動物，心臟缺血區(qū)域分4點注射40lrAAV-9HRE-hVEGF165。缺血對照組B組，n=42：模型動物，心臟缺血區(qū)分4點注射40l0.01l/LPBS。載體對照組組，n=42：模型動物，心臟缺血區(qū)分4點注射40l9HRE-LaZ。假手術(shù)組D組，n=21：正常動物，僅開胸，游離左冠狀動脈，未結(jié)扎。4組動物分別于缺血前(0)及術(shù)后2、4、6、8、10、12周取材A、B、組每時間點6只，D組3只。麻醉后取動物心臟，取材組織分別采用液氮保存Realtie-RT-PR及estern-blt檢

6、測及10%中性甲醛固定免疫組化。于缺血12周時點，另取A和B組肝臟組織，液氮保存，待estern-blt檢測。1.3.3心肌低氧誘導(dǎo)因子HIF-1及hVEGF165RNA表達(dá)檢測采用Real-tieRT-PR方法定量檢測心肌組織HIF-1及hVEGF165DNA片段。HIF-1引物：HIF-1-FP，5-ATGAGATTAAGATA-3；HIF-1-RP，5-TGGTAGGTAGGTGAATTGT-3。hVEGF165引物，HIF-1-FP,5-TATAATGAAGTG-3；HIF-1-RP,5-GAGTAGTGGTGATAGAA-3。內(nèi)參為-atin。取100g心肌組織，勻漿，離心，定量提取

7、RNA。取10l總RNA，6510in，離心15s，在相應(yīng)試管中分別參加20lHIF-1反響體系或20lhVEGF165反響體系。完成PR循環(huán)。將標(biāo)準(zhǔn)曲線樣品和待測樣品參加同一塊96孔板中，采用7300Real-tiePR儀美國AB公司定量檢測HIF-1及hVEGF165DNA片段。1.3.4esternblt測定HIF-1、hVEGF165蛋白表達(dá)每組取100g心肌組織，Lry法測定蛋白濃度。采用蛋白免疫印跡法，10%SDS電泳，半干電轉(zhuǎn)移30in。分別參加hVEGF165/HIF-1一抗(小鼠抗人VEGF165單克隆抗體，1250；小鼠抗兔HIF-1單克隆抗體，1300)，二抗為羊抗小鼠I

8、gG-AP1100)，NBT/BIP顯色，所得顯色條帶圖象掃描，半定量分析。1.3.5缺血心肌血管密度測定采用免疫組化SP法染色方法分別檢測D31及-平滑肌肌動蛋白-sthusleatin,-SA表達(dá)。石蠟切片，胰蛋白酶消化抗原修復(fù)。0.03%TritnX-100處理切片10in，PBS沖洗，5%正常羊血清封閉；分別參加一抗小鼠抗兔D31抗體，150；小鼠抗兔-SA抗體，150)，4過夜；參加羊抗小鼠二抗1200，DAB顯色。應(yīng)用HIAS2000型圖像分析系統(tǒng)武漢千屏影像公司，觀察D31及-SA免疫組化染色陽性組織切片，以直徑短徑58血管為毛細(xì)血管、直徑短徑1550血管為微動脈血管，進展圖象分

9、析，測定血管密度3。1.4統(tǒng)計學(xué)處理資料以s表示，采用單因素方差分析及q檢驗進展統(tǒng)計分析，P0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。2結(jié)果2.1缺血心肌HIF-1表達(dá)測定結(jié)果轉(zhuǎn)基因組和缺血對照組缺血心肌均可見內(nèi)源性HIF-1RNA表達(dá)，其表達(dá)呈先增后減趨勢。缺血2周，HIF-1RNA表達(dá)至峰值，而后逐漸降低。缺血12周，轉(zhuǎn)基因組HIF-1RNA表達(dá)顯著低于缺血對照組(P0.01圖1。轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.心肌梗死后，各組HIF-1蛋白表達(dá)上調(diào)，顯著高于缺血前程度P0.01，缺血4周，HIF-1蛋白表達(dá)至峰值，此后HIF-1蛋白表達(dá)呈逐漸減少趨勢。與缺血對照組比擬，缺血1012周，轉(zhuǎn)基因組HIF-1表達(dá)顯著

10、降低(P0.05圖2。2.2缺血心肌hVEGF165表達(dá)測定結(jié)果轉(zhuǎn)基因組可見hVEGF165RNA表達(dá)，其他各組均無表達(dá)。缺血4周，該組hVEGF165RNA表達(dá)至峰值P0.01；缺血12周，轉(zhuǎn)基因組hVEGF165RNA表達(dá)顯著降低，與缺血前程度比擬差異無統(tǒng)計學(xué)意義P0.05圖3。心肌缺血后，轉(zhuǎn)基因組可見hVEGF165蛋白表達(dá)，其他各組均未見其表達(dá)。缺血2周，轉(zhuǎn)基因組hVEGF165蛋白表達(dá)明顯高于其他各組(P0.01,缺血6周表達(dá)至頂峰P0.01，隨后，hVEGF165蛋白表達(dá)程度逐漸降低圖4。2.3D31+血管密度檢測結(jié)果結(jié)果顯示，缺血2周，轉(zhuǎn)基因組、缺血對照及載體對照組D31+血管密

11、度顯著低于缺血前程度。而后，轉(zhuǎn)基因組D31+血管逐漸增加；缺血1012周，與缺血前程度及缺血對照及載體對照組各相應(yīng)時點相比，轉(zhuǎn)基因組D31+血管密度顯著增加P0.01圖5。2.4-SA+血管密度檢測結(jié)果心肌缺血2周，各組-SA+血管密度均明顯減少。缺血12周，轉(zhuǎn)基因組-SA+血管密度顯著低于缺血前程度P0.01，且與缺血對照組及載體對照組相應(yīng)時點相比，差異無統(tǒng)計學(xué)意義圖6。2.5轉(zhuǎn)基因平安性檢測結(jié)果estern-blt測定結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因組心肌組織可見hVEGF165蛋白高程度表達(dá)，而該組肝臟組織，以及缺血對照組心肌和肝臟組織中均未檢測出hVEGF165蛋白圖7。3討論促血管生成轉(zhuǎn)基因治療可通

12、過促進缺血組織血管新生，改善部分血供。研究顯示，對于彌漫性缺血性心臟病而言，促血管生成轉(zhuǎn)基因治療具有良好的應(yīng)用前景。血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)是一種低氧誘導(dǎo)性血管生長因子，具有氧相關(guān)性調(diào)控血管新生的作用。本課題組既往研究顯示，將重組相關(guān)腺病毒(rAVV)攜帶hVEGF165基因轉(zhuǎn)染缺血心肌中可產(chǎn)生明顯的促血管生成作用2。HIF-1是由缺氧等因素誘導(dǎo)細(xì)胞產(chǎn)生的一種核蛋白。在病理條件下，低氧是活性HIF-1的主要誘導(dǎo)因素4-5。低氧可通過減緩其降解，增加HIF-1的穩(wěn)定性及活性HIF-1含量，后者可與HRE結(jié)合而誘導(dǎo)其下游多種基因的表達(dá)。本課題組前期在細(xì)胞程度的研究顯示，將rAVV-9H-hVE

13、GF165轉(zhuǎn)染培養(yǎng)的心肌細(xì)胞，在變化的氧環(huán)境下，低氧相關(guān)性HIF-1表達(dá)可通過與HRE結(jié)合，有效地調(diào)控心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染hVEGF165基因的表達(dá)1。本實驗結(jié)果說明，在常氧狀態(tài)下，兔內(nèi)源性HIF-1表達(dá)程度極低，而在心肌缺氧早期，HIF-1表達(dá)迅速增加，通過與9HRE的結(jié)合，有效地調(diào)控轉(zhuǎn)染hVEGF165的表達(dá)，隨著后者促血管新生作用對缺血心肌部分血供的改善，在心肌缺血后期第612周，內(nèi)源性HIF-1表達(dá)逐漸降低。分析HIF-1和hVEGF165兩者變化的互相關(guān)系，不難看出，與缺血對照組相比，缺氧早期，隨著HIF-1的高表達(dá)，基因轉(zhuǎn)染組hVEGF165RNA及VEGF蛋白表達(dá)分別在4周及6周到達(dá)頂峰

14、，顯然，該時間段是轉(zhuǎn)染hVEGF165發(fā)揮作用的最正確時間窗，從應(yīng)用角度，該結(jié)果對確定hVEGF165基因治療的有效時間點以及總體時間提供了有益的實驗根據(jù)。隨著缺血時間的延長，缺血心肌血管再生及部分缺氧的改善，HIF-1表達(dá)降低，此間，在HRE的調(diào)控下，轉(zhuǎn)染hVEGF165表達(dá)也隨之下調(diào)。根據(jù)本研究結(jié)果，在動物整體程度，在缺血心肌變化的氧環(huán)境下，HIF-1-9HRE基因調(diào)控系統(tǒng)對hVEGF165產(chǎn)生了有效地正相調(diào)控作用，HRE作為hVEGF165的氧媒介基因“開關(guān)，具有良好的靈敏性。血管新生(angigenesis)，是指芽生微小血管生成后，逐漸形成毛細(xì)血管和小肌性血管的過程。缺血心肌血管密度

15、檢測結(jié)果顯示，缺血4周，轉(zhuǎn)基因組心肌D31+血管密度顯著增高，由于hVEGF165蛋白消失的滯后性及招募血管內(nèi)皮細(xì)胞的積累6，12周缺血末，轉(zhuǎn)基因組D31+血管密度仍處較高程度。分析顯示，轉(zhuǎn)基因組D31+血管密度變化與hVEGF165表達(dá)趨勢相一致。本實驗還發(fā)現(xiàn)，缺血對照組心肌D31+血管密度遠(yuǎn)低于轉(zhuǎn)基因組，而載體對照組那么無促血管新生的作用，這也排除了內(nèi)源性HIF-1表達(dá)及rAVV載體本身對缺血心肌血管生成結(jié)果的影響。血管密度檢測結(jié)果還顯示，心肌缺血后，各組-SA+血管密度顯著減少并維持在較低程度，顯然，嚴(yán)重缺血導(dǎo)致了兔心肌血管平滑肌細(xì)胞的損傷。缺血12周，與D31+血管密度變化趨勢不同，轉(zhuǎn)

16、基因組心肌-SA+血管密度遠(yuǎn)低于缺血前程度，且與缺血對照組比擬無差異。該結(jié)果說明，盡管hVEGF165可有效地促進D31血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖，但心肌-SA低程度表達(dá)的結(jié)果那么提示，hVEGF165所誘生的毛細(xì)血管缺乏成熟血管-SA陽性肌細(xì)胞。從組織學(xué)角度分析，hVEGF165作為早期促血管生成調(diào)節(jié)因子所促生的新生血管較幼稚，組織構(gòu)造尚不完好。為此，根據(jù)本研究結(jié)果，應(yīng)當(dāng)指出，在缺血心肌血管再生應(yīng)用研究中，除應(yīng)用血管生成早期調(diào)節(jié)因子hVEGF165之外，結(jié)合應(yīng)用晚期血管生成調(diào)節(jié)因子，如Ang-、EP等，促進新生血管構(gòu)造的進一步重塑及成熟，對進步血管再生效果、改善缺血心臟功能具有重要的應(yīng)用價值。本研究結(jié)

17、果還顯示，轉(zhuǎn)rAAV-9HRE-hVEGF165缺血心肌未見血管瘤形成，亦未在其肝臟組織檢測出hVEGF165的表達(dá)。在本實驗12周心肌缺血條件下，在動物整體程度，HRE作為hVEGF165的氧媒介基因“開關(guān)具有良好的平安性。盡管如此，由于實驗觀察時間的限制，HRE對缺血心肌轉(zhuǎn)染外源性hVEGF165表達(dá)更長期的調(diào)控作用、對誘生血管功能的影響以及長期平安性，仍需進一步深化研究說明?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1張中明,姜波,董紅燕,等.低氧反響元件對低氧復(fù)氧狀態(tài)下心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染人血管內(nèi)皮生長因子165基因表達(dá)的調(diào)控作用J.中華實驗外科雜志,2022,22(12):1510-1512.2董紅燕，姜波，張中明,等.HRE對缺氧復(fù)氧心肌細(xì)胞轉(zhuǎn)染hVEGF165基因表達(dá)的調(diào)控J.中華實驗外科雜志,2022，258：1095-1097.3PnRT,NgI,Lau,etal.Turirvesseldensityasapreditrfreurreneafterresetinfhepatellulararina:aprspetivestudyJ.Jlinnl,2002,20(7):1775-1785.4HenryTD,AnnexBH,kendallG