定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)

1、定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第1頁細胞工程教研室定量蛋白質(zhì)組學(xué)定量蛋白質(zhì)組學(xué)是指把一個基因組表示全部蛋白質(zhì)或一個復(fù)雜混合體系中目標(biāo)蛋白質(zhì)進行準(zhǔn)確定量和判定。這一概念提出標(biāo)志著蛋白質(zhì)組技術(shù)不停改進和完善。蛋白質(zhì)組學(xué)研究已從對蛋白質(zhì)簡單定性向準(zhǔn)確定量方向發(fā)展。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第2頁細胞工程教研室定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第3頁細胞工程教研室主要內(nèi)容 定量技術(shù)體系與分類 熒光染料分析法 同位素標(biāo)識技術(shù) 針對性親和標(biāo)簽技術(shù) 同位素標(biāo)識技術(shù)應(yīng)用定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第4頁細胞工程教研室一 定量技術(shù)體系和分類 技術(shù)體系雙向電泳-質(zhì)譜技術(shù)體系蛋白質(zhì)芯片分析體系基于同位素標(biāo)識質(zhì)譜分析技術(shù)體系

2、定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第5頁細胞工程教研室2-DE-MS技術(shù)體系無標(biāo)識蛋白質(zhì)雙向電泳熒光差異凝膠電泳基于同位素標(biāo)簽和自動化串聯(lián)質(zhì)譜定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第6頁細胞工程教研室定量分析方法定性差異分析和定量差異分析絕對定量和相對定量凝膠差異分析和非凝膠差異分析標(biāo)識定量法和無標(biāo)識定量法定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第7頁細胞工程教研室二 熒光染料分析法雙向電泳（2-DE）凝膠染料顯示考馬斯亮藍銀染熒光染色熒光標(biāo)識定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第8頁細胞工程教研室 熒光雙向差異凝膠電泳（2D-DIGE）當(dāng)前，在傳統(tǒng)2-DE技術(shù)基礎(chǔ)上發(fā)展出2D-DIGE，采取專有熒光染料（Cy2、Cy3、Cy5）與多重樣本和圖象分析方

3、法，在同一塊膠上可同時分離多個由不一樣熒光標(biāo)識樣品，并以熒光標(biāo)識樣品混合物為內(nèi)標(biāo)，對每個蛋白質(zhì)點和每個差異都能夠進行統(tǒng)計學(xué)可信度分析，從而含有良好重復(fù)性和較高準(zhǔn)確率。另外，因為熒光染料使用，使得2D-DIGE含有高靈敏度特征，能夠滿足高通量定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究分析要求。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第9頁細胞工程教研室定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第10頁細胞工程教研室熒光掃描儀定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第11頁細胞工程教研室定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第12頁細胞工程教研室三 同位素標(biāo)識技術(shù)原理 多肽和蛋白質(zhì)質(zhì)譜響應(yīng)值受許多難以控制原因影響，尤其是其離子化效率受其它物質(zhì)和條件影響很大，含有很強體系依賴性，因而不能對來自

4、相同肽段兩次質(zhì)譜檢測得到信號強度像色譜定量中那樣進行比較定量。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第13頁細胞工程教研室一個肽惟一適合內(nèi)標(biāo)準(zhǔn)是標(biāo)識有穩(wěn)定同位素同一個肽。所以，在完整蛋白或消化后多肽中引進穩(wěn)定同位素（如2H、13C、15N、18O）標(biāo)識小分子，用來識別不一樣品起源肽段，經(jīng)“輕”質(zhì)和“重”質(zhì)同位素標(biāo)識不一樣多肽相互作為內(nèi)標(biāo)，化學(xué)性質(zhì)基礎(chǔ)上是一樣，這么就能夠確保同一次質(zhì)譜掃描中二者離子化效果是相同，此時肽質(zhì)譜峰信號成對出現(xiàn)，質(zhì)譜峰信號強度就能夠作為定量依據(jù)。它們相對強度就準(zhǔn)確地反應(yīng)了原樣品中多肽百分比（也就是蛋白百分比）。 定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第14頁細胞工程教研室 分類同位素標(biāo)簽引入方法生物代

5、謝方式化學(xué)方式酶解過程引入同位素標(biāo)識引入法體內(nèi)標(biāo)識【代謝標(biāo)識法（SILAC）】體外標(biāo)識【化學(xué)標(biāo)識法（ICAT）】定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第15頁細胞工程教研室 生物代謝方式引入標(biāo)識原理 將一定量相同種類但表示水平不一樣兩個（細胞）樣品分別置于正常培養(yǎng)介質(zhì)和富含某重質(zhì)同位素（如：15N）相同介質(zhì)中培養(yǎng)，一定時間后將二者混合酶解，然后選擇性親和分離、色譜分離，并進行質(zhì)譜分析。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第16頁細胞工程教研室方法15N/14N蛋白質(zhì)標(biāo)識技術(shù) 分別用富含15N/14N細胞培養(yǎng)基培養(yǎng)要比較細胞或者簡單生物體，經(jīng)過生物代謝方式以15N替換氨基酸組成中14N，進而把15N標(biāo)識引入蛋白質(zhì)組成中。因為

6、氨基酸組成不固定（從甘氨酸1個到精氨酸4個），所以還沒有把此標(biāo)識用在細胞培養(yǎng)上報道。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第17頁細胞工程教研室細胞培養(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素標(biāo)簽技術(shù)（SILAC） 經(jīng)過細胞正常代謝，把穩(wěn)定同位素標(biāo)識氨基酸引入到蛋白質(zhì)組成中，大大簡化質(zhì)譜定量分析前人工處理復(fù)雜度?？捎迷诩毎囵B(yǎng)條件下穩(wěn)定同位素有： 2H、13C和15N等。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第18頁細胞工程教研室定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第19頁細胞工程教研室 酶解過程引入標(biāo)識18O/16O水 在兩個要比較蛋白質(zhì)樣品酶解過程中分別加入18O和16O水，這么可特異性地對酶解肽段C末端進行標(biāo)識，等量混合后進行質(zhì)譜分析樣品間蛋白質(zhì)組差異?；?/p>

7、合樣品須快速判定。酶解標(biāo)識H218O 在H218O溶液中進行蛋白質(zhì)酶解，可在其C端穩(wěn)定結(jié)合1或2個18O原子。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第20頁細胞工程教研室整體內(nèi)標(biāo)技術(shù)（GIST） 經(jīng)過用N-acetoxy-2H3-succinimide/ N-acetoxy-succinimide(NAS)乙酰化處理酶解肽段，把同位素標(biāo)簽引入樣本分析體系中。NAS可標(biāo)識必需氨基酸親和肽段N末端。因為肽段乙?；稽c不一，被標(biāo)識重鏈和輕鏈質(zhì)量差也不固定，給自動化分析帶來了一定困難。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第21頁細胞工程教研室親和標(biāo)簽法引入標(biāo)識原理 同位素標(biāo)識親和標(biāo)簽技術(shù)（ICAT）由Gygi等于1999年創(chuàng)造。此

8、技術(shù)是利用同位素親和標(biāo)簽試劑，預(yù)先選擇性地標(biāo)識某一類蛋白質(zhì)，分離純化之后進行MS判定。依據(jù)MS圖上不一樣同位素標(biāo)識親和標(biāo)簽試劑標(biāo)識一對肽段離子強度比值定量分析樣品相對豐度。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第22頁細胞工程教研室ICAT試劑組成：反應(yīng)基團（特異性結(jié)合肽鏈中半胱氨酸殘基巰基）連接子（結(jié)合穩(wěn)定同位素）親和標(biāo)簽生物素（可與卵白素結(jié)合，選擇性分離標(biāo)識多肽）定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第23頁細胞工程教研室操作流程同位素標(biāo)識親和標(biāo)簽輕試劑標(biāo)識細胞蛋白質(zhì)1同位素標(biāo)識親和標(biāo)簽重試劑標(biāo)識細胞蛋白質(zhì)2混合，胰酶水解陽離子交換卵白素親和層析LC分離，MS分析，數(shù)據(jù)庫檢索定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第24頁細胞工程教研室優(yōu)

9、點兼容任何生長條件下組織中蛋白質(zhì)樣品；烷基化反應(yīng)高度特異；只分離含有半胱氨酸殘基肽段，降低了體系復(fù)雜性；可對膜蛋白進行判定和定量；建立在色譜技術(shù)基礎(chǔ)上，任何促進蛋白質(zhì)溶解試劑都可使用；能直接判定和測量低豐度蛋白質(zhì)。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第25頁細胞工程教研室缺點無法分析不含半胱氨酸蛋白質(zhì)；同位素標(biāo)簽存在影響肽段檢測和增加數(shù)據(jù)庫搜索復(fù)雜性；被標(biāo)識含有兩個半胱氨酸多肽質(zhì)量相差16u時與氧化作用極難區(qū)分；樣品成份復(fù)雜時，定量誤差會增大標(biāo)識效率含有時間依賴性，極難到達80%。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第26頁細胞工程教研室應(yīng)用測定和定量膜蛋白判定和定量低豐度蛋白質(zhì)定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第27頁細胞工程教研

10、室 ICAT技術(shù)改進用13C/12C代替2H/1H，消除LC同位素效應(yīng)固相同位素標(biāo)識親和標(biāo)簽可剪切同位素標(biāo)識親和標(biāo)簽（酸切 割或光切割）可裂解同位素標(biāo)識親和標(biāo)簽（cICAT）可視同位素標(biāo)識親和標(biāo)簽（VICAT）定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第28頁細胞工程教研室固相同位素標(biāo)識親和標(biāo)簽其是將ICAT試劑與玻璃珠結(jié)合，使之固相化，經(jīng)過固相捕捉和釋放等化學(xué)反應(yīng)過程，LCMS-MS分析蛋白質(zhì)肽段。該方法與傳統(tǒng)ICAT方法相比，更簡單，更靈敏，更有效。而最大不一樣是固相ICAT試劑標(biāo)識蛋白質(zhì)是在酶解后進行，而ICAT試劑標(biāo)識蛋白質(zhì)要求在酶解前。固相同位素標(biāo)簽試劑由4個別組成，氨丙基包被玻璃珠、含有O-硝基苯光裂

11、解連接子、連接7個氫或7個氘亮氨酸同位素標(biāo)簽和巰基特異反應(yīng)碘乙酰胺基團。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第29頁細胞工程教研室可裂解同位素標(biāo)識親和標(biāo)簽用13C/12C代替了2H/1H使用了酸裂解連接子不一樣肽段質(zhì)量相差9u或9u倍數(shù)親和標(biāo)簽試劑由3個別組成半胱氨酸特異性反應(yīng)基團含9個同位素13C或12C標(biāo)簽可裂解連接子親和純化生物素定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第30頁細胞工程教研室可視同位素標(biāo)識親和標(biāo)簽是在cICAT技術(shù)基礎(chǔ)上實現(xiàn)絕對定量改進方法。親和標(biāo)簽試劑由3種不一樣同位素標(biāo)簽組成。用來標(biāo)識樣品巰基標(biāo)識標(biāo)簽（VICAT）標(biāo)識內(nèi)標(biāo)多肽標(biāo)簽（14C-VICAT+6）等電聚焦標(biāo)識標(biāo)簽（14C-VICAT-28）

12、定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第31頁細胞工程教研室定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第32頁細胞工程教研室同位素標(biāo)識相對定量和絕對定量ICAT技術(shù)每次試驗只能對兩個樣品進行相對定量。新近出現(xiàn)多重元素標(biāo)識同位素標(biāo)識相對和絕對定量技術(shù)（iTRAQ）在一定程度上處理了這一問題。它是年由ABI企業(yè)推出一個能夠同時對四組樣品進行定量分析方法，對于試驗設(shè)計比較多組樣品給予了有力支持。 定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第33頁細胞工程教研室iTRAQ試劑是非多聚體等質(zhì)量標(biāo)識試劑，是由四種試劑組成一組試劑，這四種試劑分子量相同。每一個試劑都包含三個別：一個匯報基團（分子量分別為114u、115u、116u和117u）、一個平衡基團（分子

13、量分別為31u、 30u、29u和28u）和一個與肽段反應(yīng)基團。當(dāng)咱們需要同時比較四組不一樣品時，樣品分別跟四種iTRAQ試劑結(jié)合，然后混合在一起做質(zhì)譜判定。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第34頁細胞工程教研室定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第35頁細胞工程教研室與ICAT試劑相比優(yōu)點是通量大。iTRAQ試劑對氨基標(biāo)識是一個普遍標(biāo)識模式，它幾乎全部肽段都能被標(biāo)識。不過，假如用這種普遍標(biāo)識方法來大規(guī)模判定和定量蛋白質(zhì)(理論上說，每個蛋白質(zhì)只要有一條肽段就能夠?qū)ζ溥M行判定和定量)，則是一件費時費勁事情。另外，在iTRAQ試劑標(biāo)識需要反應(yīng)體系有機相體積高達60以上，蛋白質(zhì)樣品很輕易發(fā)生沉淀而損失，這也是該試劑一個弱點

14、。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第36頁細胞工程教研室四 針對性親和標(biāo)簽技術(shù) 磷酸化蛋白質(zhì)同位素標(biāo)識親和標(biāo)簽PHIAT技術(shù)是建立在ICAT技術(shù)基礎(chǔ)上研究和判定磷酸化蛋白質(zhì)磷酸化位點新方法，且對低豐度蛋白質(zhì)判定有效。PHIAT試劑含有親核巰基和同位素標(biāo)簽及其共價結(jié)合生物素基團。利用此方法已成功判定了酪蛋白和酵母提取物磷酸化位點。定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第37頁細胞工程教研室選擇性標(biāo)識特異性氨基酸同位素化學(xué)探針標(biāo)識半胱氨酸標(biāo)識色氨酸標(biāo)識氨基酸N末端標(biāo)識羧基標(biāo)識定量蛋白質(zhì)組學(xué)研究技術(shù)第38頁細胞工程教研室非同位素化學(xué)探針標(biāo)識 （Label-free LC MS/MS ）賴氨酸標(biāo)識 質(zhì)量豐度編碼標(biāo)簽（MCAT）是一個色譜標(biāo)識定量法。組氨酸標(biāo)識 利用了固相金屬親和色譜可富集