生物制藥工藝概述

1、生物制藥工藝概述生物制藥工藝概述第1頁本門課程由以下三大個(gè)別內(nèi)容組成基礎(chǔ)篇：生物制藥工藝基礎(chǔ)1技術(shù)篇： 生物分離工程技術(shù)2品種篇：主要生物藥品制造工藝3生物制藥工藝概述第2頁生物藥品類別（一）天然生物藥品 1.微生物藥品 microbil medicine 2.生化藥品（含海洋藥品） Biochemical medicine（Marine medicine）（二）生物技術(shù)藥品（新生物制品） 1.DNA重組藥品（DNA recombinant medicine）基因工程與蛋白質(zhì)工程藥品 2. 基因藥品（三）合成或半合成生物藥品生物制藥工藝概述第3頁生化藥品定義、分類、特點(diǎn)定義：詳細(xì)利用生物化學(xué)研

2、究方法，從生物體中經(jīng)提取、分離、純化等伎倆取得天然存在生化活性物質(zhì)或?qū)⑸鲜鲞@些物質(zhì)加以結(jié)構(gòu)改造或人工合成創(chuàng)造出自然界沒有新活性物質(zhì)，通稱生化藥品(Biochemical medicine)。生物制藥工藝概述第4頁酶類藥品輔酶類藥品核苷酸與核酸類藥品多肽類藥品氨基酸類藥品蛋白質(zhì)類藥品多糖類藥品脂類藥品分 類生物制藥工藝概述第5頁特 點(diǎn)1普通生物學(xué)特征：1天然生物藥品是生物進(jìn)化與自然選擇結(jié)果、組成結(jié)構(gòu)常較復(fù)雜，分子量普通較大，生物活性受到各種原因影響起源于生物體或其基因表示產(chǎn)物及其修飾物，活性高，針對(duì)性強(qiáng)，含有補(bǔ)充調(diào)整、增強(qiáng)、抑制、替換或糾正代謝失調(diào)功效。普通比化學(xué)藥品更合理和更有效，毒性較低、安

3、全性較高，副作用較小。2天然生物藥品是新型生物藥品先導(dǎo)物，經(jīng)過合理藥品設(shè)計(jì)，能夠創(chuàng)制療效更高，作用更專一，更易為機(jī)體接收，副作用與不良反應(yīng)更小新藥。3生物制藥工藝概述第6頁特 點(diǎn)2特殊生物學(xué)特征：1種屬特異性免疫原性2非預(yù)期多向性活性，一個(gè)細(xì)胞因子可有各種生物活性，各種細(xì)胞因子經(jīng)過網(wǎng)絡(luò)效應(yīng)可產(chǎn)生同種生物活性。3生物制藥工藝概述第7頁特 點(diǎn)3化學(xué)特征：1含量低、雜質(zhì)多、工藝復(fù)雜、收率低、技術(shù)要求高；結(jié)構(gòu)復(fù)雜，生物活性受空間結(jié)構(gòu)嚴(yán)格限制，穩(wěn)定性差；2劑量小，活性高，對(duì)制品均一性，有效性，安全性，穩(wěn)定性，生物活性要求嚴(yán)格。故常有國際標(biāo)準(zhǔn)品對(duì)照品作為測(cè)試對(duì)照。3生物制藥工藝概述第8頁80年代至今70-

4、80年代50-70年代有機(jī)溶劑分級(jí)分離、等電沉淀-粗提物。離子交換層析、凝膠層析、超濾等技術(shù)-提升了產(chǎn)品純度和收率各種層析技術(shù)、超速離心等-高純度生化藥品生物制藥工藝概述第9頁尿激酶從每1mg蛋白質(zhì)活力不得少于35，000單位提升到100，000單位，高于英國藥典及歐洲藥典水平（70，000單位），與日本藥典相同。胰島素，激肽釋放酶都與國外先進(jìn)水平相當(dāng)。輔酶A標(biāo)準(zhǔn)從220U/mg提升到250u/mg。肝素鈉出口產(chǎn)品也超出國外藥典標(biāo)準(zhǔn)生物制藥工藝概述第10頁生物藥品資源植 物動(dòng) 物動(dòng)物臟器血液、分泌物及其它代謝物微 生 物海 洋 生 物生物制藥工藝概述第11頁主要從以下臟器中制取生化藥品生物制藥

5、工藝概述第12頁毒蜥Exendin-4是自毒蜥唾液中提取一個(gè)多肽，研究發(fā)覺該多肽與人體內(nèi)GLP-1在序列上有53同源性，同GLP-1一樣含有促進(jìn)胰島素分泌、抑制胰高血糖素分泌及保護(hù)胰島細(xì)胞等作用。年經(jīng)FDA同意用于二型糖尿病治療。Exenatide是Exendin-4人工合成品。Exenatide生物制藥工藝概述第13頁麻省Transmolecular企業(yè)科學(xué)家將放射性I131附著于自蝎子毒液中提取一個(gè)多肽制成藥品，研究發(fā)覺該藥品含有靶向性，對(duì)晚期神經(jīng)膠質(zhì)瘤有很好療效，患者只需要從外部注射這種化合物，而無需再進(jìn)行化療或放射治療。該藥品當(dāng)前仍處于臨床研究階段。蝎 毒 肽生物制藥工藝概述第14頁微

6、 生 物1利用微生物作為工具微生物代謝物 2微生物菌體3生物制藥工藝概述第15頁海 洋 生 物1海藻類：已知海藻有1萬各種海洋動(dòng)物類：腔腸動(dòng)物類、節(jié)肢 動(dòng)物類、軟體動(dòng)物類、魚類、爬行動(dòng) 物類、海洋哺乳動(dòng)物類2海洋微生物：3生物制藥工藝概述第16頁僧袍芋螺齊考諾肽（ziconotide）最初由僧袍芋螺中提取，現(xiàn)已人工合成，是一個(gè)神經(jīng)細(xì)胞鈣通道阻斷劑。作為一個(gè)非阿片類鎮(zhèn)痛藥品，用于治療嚴(yán)重慢性神經(jīng)性疼痛，其鞘內(nèi)注射劑經(jīng)FDA同意于年上市。 齊考諾肽（ziconotide）生物制藥工藝概述第17頁Didemnin B是一個(gè)由7個(gè)氨基酸和2個(gè)羧酸組成帶有分枝環(huán)縮肽,既能抑制蛋白質(zhì)合成,也能抑制DNA、

7、RNA合成,對(duì)黑色素瘤B16細(xì)胞周期作用研究表明,它可殺傷各期細(xì)胞,尤以G1至S期細(xì)胞敏感 ，它可快速完全介導(dǎo)HL-60細(xì)胞凋亡。當(dāng)前Didemin B已能夠人工全合成,該藥完成了臨床期試驗(yàn),最有希望開發(fā)成治療癌癥新藥。另外第二代didemnins-脫氫didemnins B(aplidine)現(xiàn)也已進(jìn)入臨床試驗(yàn)。 海鞘起源抗癌肽 Didemnin B生物制藥工藝概述第18頁海兔體內(nèi)存在著各種結(jié)構(gòu)獨(dú)特、生理功效各異次生代謝產(chǎn)物,如萜類、毒素、甾體、大環(huán)內(nèi)酯及肽類等,其中肽類化合物尤為引人注目。其中 Dolastatin15和Dolastatin10已經(jīng)完成全合成,并正在美國進(jìn)行期和期臨床試驗(yàn),

8、主要用于小細(xì)胞肺癌、卵巢癌、黑色素瘤和前列腺癌等實(shí)體瘤治療。 海兔起源抗癌作用肽生物制藥工藝概述第19頁氨基酸類分類1蛋白質(zhì)氨基酸：編碼氨基酸非蛋白氨基酸：D型氨基酸、-氨基酸、-氨基酸等2衍生氨基酸：谷氨酰胺、硫酸甘氨酸、磷葡精氨酸等 3生物制藥工藝概述第20頁生物制藥工藝概述第21頁氨基酸生產(chǎn)方法蛋白水解法：胱氨酸、半胱氨酸 化學(xué)合成法：甘氨酸、蛋氨酸、丙氨 酸、苯丙氨酸、絲氨酸等發(fā)酵法：蘇氨酸、異亮氨酸、纈氨酸、精氨 酸、組氨酸、脯氨酸、鳥氨酸、瓜 氨酸、賴氨酸、亮氨酸等酶法：丙氨酸、天冬氨酸、色氨酸等生物制藥工藝概述第22頁微生物，植物細(xì)胞，動(dòng)物細(xì)胞化學(xué)合成，生物合成，天然存在底 物(

9、AA前體)生物反應(yīng)器含L-AA反應(yīng)液L-AA酶轉(zhuǎn)化法生產(chǎn)L-AA流程生物制藥工藝概述第23頁結(jié) 構(gòu)分子量等電點(diǎn)性 質(zhì)溶解性L-AspL-Ala L-Asp和L-Ala結(jié)構(gòu)與性質(zhì)133.1089.092.776.0酸性氨基酸中性氨基酸溶于水和鹽酸，不溶于乙醇和乙醚在水中有一定溶解性，不溶于丙酮及乙醚生物制藥工藝概述第24頁+CO2天冬氨酸酶L-Asp脫羧酶酶轉(zhuǎn)化反應(yīng)工藝路線固定化 L-Asp脫羧酶轉(zhuǎn)化液B延胡索酸+ NH3固定化 天冬氨酸酶轉(zhuǎn)化液AL-Asp粗品L-Asp精品L-Ala粗品L-Ala精品生物制藥工藝概述第25頁泵儲(chǔ)罐反應(yīng)產(chǎn)物離心機(jī)母液回收固定化酶柱子晶體 L-AspL-Asp延胡

10、索酸氨鹽工 藝 路 線生物制藥工藝概述第26頁氨基酸輸液組方原理與配方模式生物制藥工藝概述第27頁不一樣類型AA輸液，依據(jù)在臨床上用途不一樣能夠分為以下幾類：生物制藥工藝概述第28頁多肽蛋白類藥品生物制藥工藝概述第29頁生物制藥工藝概述第30頁多肽類藥品分類：多肽激素 垂體多肽激素 促皮質(zhì)素（ACTH）、促黑激素（MSH）、脂肪水解激 素（LPH） 催產(chǎn)素（OT），加壓素 （AVP）等 下丘腦激素促甲狀腺激素釋放激素（TRH）、生長(zhǎng)素抑制激素（GRIF）、促性腺激素釋放激素（LHRH） 甲狀腺激素 甲狀旁腺激素（PTH）、降鈣素（CT） 胰島激素 胰高血糖素 胰解痙多肽 胃腸道激素 胃泌素、膽

11、囊收縮素促胰酶素（CCK-PZ）、腸泌素、腸血管 活性肽（VIP）、抑胃素（GIP）、緩激肽、P物質(zhì) 胸腺激素胸腺素、胸腺肽、胸腺血清因子生物制藥工藝概述第31頁多肽類細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)整因子表皮生長(zhǎng)因子（EGF），轉(zhuǎn)移因子（TF），心鈉素（ANP）等。含有多肽成份其它生化藥品 骨寧、眼生素、血活素、氨肽素、婦血寧、腦氨肽、蜂毒、蛇毒、胚胎素、 助應(yīng)素、神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)素、胎盤提取物、花粉 提取物、脾水解物、肝水解物、心臟激素等。多肽類藥品分類：生物制藥工藝概述第32頁蛋白質(zhì)激素 垂體蛋白質(zhì)激素生長(zhǎng)素（GH），催乳激素（PRL），促甲狀腺素（TSH），促黃體生成激素（LH），促卵泡激素（FSH）。 促性腺激素

12、人絨毛膜促性腺激素（HCG），絕經(jīng)尿促性腺激素（HMG），血清性促性腺激素（SGH）。 胰島素及 其它蛋白質(zhì)激素胰島素，胰抗脂肝素，松弛素，尿抑胃素。 血漿蛋白質(zhì)白蛋白，纖維蛋白溶酶原，血漿纖維結(jié)合蛋白（FN）,免疫丙種球蛋白，抗淋巴細(xì)胞免疫球蛋白，Veils病免疫球蛋白，抗D免疫球蛋白，抗HBs免疫球蛋白，抗血友病球蛋白，纖維蛋白原，抗凝血酶，凝血因子，凝血因子。蛋白質(zhì)類藥品分類生物制藥工藝概述第33頁蛋白質(zhì)類細(xì)胞生長(zhǎng)調(diào)整因子干擾素、（IFN）,白細(xì)胞介素17（IL），神經(jīng)生長(zhǎng)因子（NGF），肝細(xì)胞生長(zhǎng)因子（HGF），血小板衍生生長(zhǎng)因子（PDGF），腫瘤壞死因子(TNF)，集落刺激因子(CS

13、F)， 組織纖溶酶原激活因子(tPA)，促紅細(xì)胞生成素(EPO)，骨發(fā)生蛋白（BMP）。粘蛋白胃膜素、硫酸糖肽、內(nèi)在因子等。膠原蛋白明膠、阿膠等堿性蛋白質(zhì)硫酸魚精蛋白蛋白酶抑制劑胰蛋白酶抑制劑凝集素PHA、ConA蛋白質(zhì)類藥品分類生物制藥工藝概述第34頁多肽化學(xué)合成概述合成原理：是一個(gè)重復(fù)添加AA過程，普通自C端向N端合成。合成方法： （1）液相合成 （2）固相合成 （1963年R.B.Merrifield 創(chuàng)建，并所以獲1984年 獲諾貝爾化學(xué)獎(jiǎng)）1953年Du.Vigneaud等合成催產(chǎn)素（oxytocin,OXT ，9AA單鏈肽）1963年合成促腎上腺皮質(zhì)激素（ACTH，39AA單鏈肽）

14、1965年中國科學(xué)家合成了胰島素（Insulin，51AA雙鏈肽）生物制藥工藝概述第35頁多肽合成主要步驟 氨基保護(hù)和羧基活化 羧基保護(hù)和氨基活化 接肽和去保護(hù)基氨基保護(hù)基 芐氧羰基強(qiáng)酸脫除 叔丁氧羰基（BOC）三氟乙酸（TFA）脫除 9-芴甲氧羰基（Fmoc）堿脫除 生物制藥工藝概述第36頁多肽固相合成(Fmoc保護(hù)法)（1978年改進(jìn)方法，防止了強(qiáng)酸處理）生物制藥工藝概述第37頁原料選擇上 清破碎 提取沉 淀 變性 復(fù)性蛋白質(zhì)純化蛋白質(zhì)藥品Separation and Purification純度 活性判定合格不合格精品 發(fā) 酵 生物 組織生物制藥工藝概述第38頁 Protein-Sepa

15、ration原則：富含所需蛋白質(zhì)多肽成分的，易于獲得、易于提取、無害 （原核、真核發(fā)酵；生物組織）注意事項(xiàng)：種屬、發(fā)育生長(zhǎng)階段、原料的環(huán)境、解剖部位、生物狀態(tài)溶解性 穩(wěn)定性 合適的溶劑原料選擇提取生物制藥工藝概述第39頁P(yáng)rotein-Purification 純化 依據(jù)目標(biāo)蛋白與雜質(zhì)之間差異進(jìn)行純化。1.依據(jù)蛋白質(zhì)pI不一樣進(jìn)行純化，其方法有：1）pI沉淀法 2）pI沉淀法與鹽析法相結(jié)合3）等電聚焦法 2.蛋白質(zhì)分子形狀和大小不一樣進(jìn)行純化，其方法有 1）凝膠過濾 2）超濾法 3） 離心法 4）透析法3.蛋白質(zhì)溶解度不一樣進(jìn)行純化，其方法有： a)鹽溶與鹽析法 b）結(jié)晶法 c）有機(jī)溶劑沉淀法

16、4.蛋白質(zhì)電離性質(zhì)不一樣進(jìn)行分離：離子交換法5.蛋白質(zhì)功效專一性不一樣進(jìn)行純化：親和層析法、假親和層析法6.蛋白質(zhì)在溶劑系統(tǒng)中分配不一樣進(jìn)行純化：萃取法7.蛋白質(zhì)選擇性吸附性質(zhì)進(jìn)行純化：吸附法8.蛋白質(zhì)其它特殊性質(zhì)進(jìn)行純化生物制藥工藝概述第40頁分離純化方法選擇1.分離純化早期使用方法選擇特點(diǎn)：提取液中物質(zhì)十分復(fù)雜，目標(biāo)蛋白濃度較稀。方法選擇標(biāo)準(zhǔn)：低分辨能力到高分辨能力，而且負(fù)荷量較大為適當(dāng)。2.各種分離純化方法使用程序標(biāo)準(zhǔn)：相同性質(zhì)純化方法普通不重復(fù)使用。純化方法次序先后安排上要考慮到有利于降低工序，提升效率。3.分離純化后期保護(hù)性辦法4對(duì)每一步驟方法優(yōu)勢(shì)進(jìn)行綜合評(píng)價(jià) 每一個(gè)分離純化步驟方法

17、好壞，除了從分辨本事和重現(xiàn)性二方面考慮外， 還注意方法本身回收率高低。生物制藥工藝概述第41頁純化方法選擇指南生物制藥工藝概述第42頁豬胰島素牛胰島素賴脯人胰島素（禮來企業(yè)、速效Ins） 門冬胰島素 （諾和諾德企業(yè)、速效Ins ） 甘精胰島素 (安萬特企業(yè)、長(zhǎng)期有效Ins)人胰島素（Insulin）B30 A8 ;A10 ;B30 B28 ;B29B28 A21 ;B31 ;B32 生物制藥工藝概述第43頁3D Structure of Insulin胰島素二聚體（dimer）胰島素六聚體（hexamer ）生物制藥工藝概述第44頁當(dāng)前臨床使用胰島素起源 動(dòng)物胰臟起源-經(jīng)動(dòng)物胰臟提取或適當(dāng)提純

18、豬、牛胰島素 半合成胰島素-以豬胰島素為原料，酶修飾后得到人胰島素重組DNA技術(shù)生產(chǎn)胰島素-重組DNA技術(shù)生產(chǎn)人胰島素、速效胰島素、長(zhǎng)期有效胰島素生物制藥工藝概述第45頁1921年-從動(dòng)物胰腺中提取出胰島素，開創(chuàng)了人類胰島素治療歷史。1926年-重結(jié)晶胰島素1930s-傳統(tǒng)中、長(zhǎng)期有效動(dòng)物胰島素1970s-單峰胰島素和 單組分胰島素 70年代末-半合成胰島素1982年-采取基因重組技術(shù)生產(chǎn)人胰島素正式上市。90年代至今-重組人胰島素類似物成功研發(fā)上市，包含超短效和長(zhǎng)期有效人胰島素類似物。 生物制藥工藝概述第46頁動(dòng)物起源胰島素（28種）藥品名稱生產(chǎn)企業(yè)藥品名稱生產(chǎn)企業(yè)ILETIN I LILL

19、Y NPH PURIFIED PORK ISOPHANE INSULIN NOVO NORDISK INC ILETIN II LILLY PROTAMINE ZINC & ILETIN I (BEEF-PORK) LILLY INSULIN NOVO NORDISK INC PROTAMINE ZINC AND ILETIN II LILLY INSULIN INSULATARD NPH NORDISK NOVO NORDISK INC PROTAMINE ZINC AND ILETIN II (PORK) LILLY INSULIN NORDISK MIXTARD (PORK) NOVO

20、NORDISK INCPROTAMINE ZINC INSULIN BRISTOL MYERS SQUIBB LENTARD NOVO NORDISK INC REGULAR ILETIN II LILLY LENTE NOVO NORDISK INC REGULAR ILETIN II (PORK) LILLY LENTE ILETIN II LILLY REGULAR PURIFIED PORK INSULIN NOVO NORDISK INC LENTE ILETIN II (PORK) LILLY REGULAR INSULIN NOVO NORDISK INCLENTE INSULI

21、N NOVO NORDISK INC SEMILENTE NOVO NORDISK INC NPH ILETIN I (BEEF-PORK) LILLY SEMILENTE INSULIN NOVO NORDISK INC NPH ILETIN II LILLY ULTRALENTE NOVO NORDISK INC NPH ILETIN II (PORK) LILLY ULTRALENTE INSULIN NOVO NORDISK INCNPH INSULIN NOVO NORDISK INC VELOSULIN NOVO NORDISK INC 生物制藥工藝概述第47頁半合成起源胰島素（5

22、種）藥品名稱生產(chǎn)企業(yè)INSULATARD NPH HUMAN NOVO NORDISK INC MIXTARD HUMAN 70/30 BAYER PHARMS NOVOLIN 70/30 NOVO NORDISK INCNOVOLIN L NOVO NORDISK INCNOVOLIN N NOVO NORDISK INC生物制藥工藝概述第48頁基因重組起源胰島素（27種）藥品名稱生產(chǎn)企業(yè)藥品名稱生產(chǎn)企業(yè)APIDRA SANOFI AVENTIS US LANTUS SANOFI AVENTIS US EXUBERA PFIZER LEVEMIR Novo Nordisk HUMALOG L

23、ILLY MIXTARD HUMAN 70/30 BAYER PHARMS HUMALOG MIX 50/50 LILLY NOVOLIN 70/30 Novo NordiskHUMALOG MIX 75/25 LILLY NOVOLIN L NOVO NORDISK INC HUMALOG PEN LILLYNOVOLIN N NOVO NORDISK INC HUMULIN 50/50 LILLY NOVOLIN R NOVO NORDISK INC HUMULIN 70/30 LILLY NOVOLIN R（Purified）NOVO NORDISK INC HUMULIN 70/30

24、PEN LILLYNOVOLOG NOVO NORDISK INC HUMULIN BR LILLYNOVOLOG MIX 70/30 NOVO NORDISK INC HUMULIN L LILLYVELOSULIN BR NOVO NORDISK INC HUMULIN N LILLYVELOSULIN BR HUMANNOVO NORDISK INC HUMULIN R LILLYHUMULIN U LILLYHUMULIN R PEN LILLY生物制藥工藝概述第49頁通化東寶 1998年12月研制出中國第一支基因重組胰島素“甘舒霖” 甘舒霖 R- 常規(guī)重組人胰島素注射液 甘舒霖 N-

25、 低精蛋白重組人胰島素注射液 甘舒霖 30R- 30/70混合重組人胰島素注射液 （ 30%常規(guī)重組人胰島素和70%低精蛋白重組人胰島素）深圳科興 蘇泌啉- 常規(guī)重組人胰島素注射液 蘇泌啉恩- 低精蛋白重組人胰島素注射液 徐州萬邦 萬邦林- 常規(guī)重組人胰島素注射液 萬蘇林豬胰島素制劑胰島素我國主要生產(chǎn)廠家其它（持有藥品注冊(cè)證） -南京新天生物化學(xué)制藥有限企業(yè)、華西醫(yī)科大學(xué)制藥廠、上海第一生化 制藥廠、武漢生化制藥廠 等生物制藥工藝概述第50頁臨床用胰島素分類普通胰島素：從動(dòng)物胰臟中提取人胰島素傳統(tǒng)中長(zhǎng)期有效胰島素 長(zhǎng)期有效人胰島素類似物速效人胰島素類似物非注射胰島素生物制藥工藝概述第51頁傳統(tǒng)

26、中長(zhǎng)期有效胰島素制劑 低精蛋白鋅胰島素：胰島素、魚精蛋白和鋅結(jié)晶。 例：禮來企業(yè)， Humulin N(rDNA、大腸桿菌) 諾和諾德， Novolin N (rDNA、釀酒酵母) 胰島素鋅混懸液：精蛋白鋅胰島素與常規(guī)胰島素混懸液 例：禮來企業(yè)， Humulin 30/70 (30%常規(guī)胰島素，70%精蛋白鋅胰島素) Humulin 50/50 諾和諾德， Novolin 30/70 Novolin 50/50缺點(diǎn)：作用時(shí)間少于24小時(shí)作用峰值顯著，夜間低血糖危險(xiǎn)性高吸收不穩(wěn)定結(jié)霜現(xiàn)象，因?yàn)闇囟冗^冷或過熱造成胰島素再玻璃瓶壁沉淀，喪失活性生物制藥工藝概述第52頁速效胰島素特點(diǎn)：起效快，皮下注射

27、后15分鐘起效。 達(dá)峰快，注射后15分鐘起效，3060分鐘到達(dá)藥效高峰。藥效維持時(shí)間短，大約在3小時(shí)左右（24小時(shí)）。 藥代動(dòng)力學(xué)特點(diǎn)與進(jìn)餐后人體內(nèi)源性胰島素分泌十分相同，能夠很好地控制當(dāng)餐后血糖而且不輕易發(fā)生低血糖。起效時(shí)間 達(dá)峰時(shí)間峰連續(xù)時(shí)間 作用消除時(shí)間常規(guī)皮下Ins: 30-90min1.5-2.5h 2-4h6-8h生理Ins：0-20min30-45min2-3h3-4h生物制藥工藝概述第53頁 B26-30對(duì)于胰島素結(jié)合于胰島素受體功效無關(guān)，不過對(duì)胰島素形成二聚體相關(guān)結(jié)構(gòu)特點(diǎn) 。所以對(duì)此區(qū)段進(jìn)行修飾將產(chǎn)生一些自聚合能力下降不過與胰島素受體結(jié)合能力不變新型速效胰島素類似物 。研制機(jī)

28、理已上市藥品： Lispro 、 Aspart、Apidra生物制藥工藝概述第54頁 Lispro （賴脯胰島素 ，Humalog ）是第一個(gè)用于臨床速效胰島素類似物,由美國禮來企業(yè)研制生產(chǎn)，將人胰島素B28與B29位氨基酸對(duì)換。 Aspart（門冬胰島素，Novolog ）由丹麥諾和諾德企業(yè)研制生產(chǎn)，結(jié)構(gòu)與人胰島素區(qū)分在于用天冬氨酸取代了B鏈28位上脯氨酸。APIDRA （賴谷胰島素，Apidra ）安萬特企業(yè)研制，以賴氨酸和谷氨酸分別取代了人胰島素B3位天冬氨酸和B29位賴氨酸。生物制藥工藝概述第55頁長(zhǎng)期有效胰島素-人胰島素類似物1. 甘精胰島素（ glargine ）： 商品名Lant

29、us-甘氨酸替換胰島素A鏈21位門冬氨酸、并在B鏈末端增加兩 個(gè)精氨酸。 使胰島素結(jié)合更多帶正電氨基酸殘基，改變等電點(diǎn)，使等電點(diǎn)由5.4上升至中性。這么，胰島素類似物在酸性條件下可溶，在生理近中性條件下結(jié)晶。2. Insulin Detemir：商品名Levemir -胰島素B鏈29位賴氨酸側(cè)鏈經(jīng)過?；B接一個(gè)N-16-烷基 酸14碳游離脂肪酸該游離脂肪酸能與白蛋白結(jié)合，延緩與胰島素受體結(jié)合，從而延長(zhǎng)其半衰期。 生物制藥工藝概述第56頁Insulin Detemir（Levemir ）諾和諾德企業(yè)研制 glargine （Lantus）安萬特企業(yè)研制生物制藥工藝概述第57頁胰島素肺部吸入制劑

30、-Exubera輝瑞、萬安特以及Nektar 共同研發(fā)于.1.27被FDA同意一個(gè)作用快胰島素干粉吸入劑適合用于餐前給藥，其胰島素吸收含有速效化特征生物制藥工藝概述第58頁胰島素制備工藝 以動(dòng)物胰臟為原料提取胰島素 -酸醇提取法 傳統(tǒng)胰島素-豬、牛胰臟提取，只經(jīng)一步重結(jié)晶 單峰胰島素-凝膠過濾純化 單組分胰島素-凝膠過濾、離子交換純化 半合成胰島素-以豬胰島素為原料，酶修飾后得到人胰島素重組DNA技術(shù)生產(chǎn)人胰島素 AB鏈合成：分別表示AB鏈，化學(xué)方法連接 逆轉(zhuǎn)錄法：表示胰島素原，酶切得到重組人胰島素生物制藥工藝概述第59頁Ins性質(zhì) 生物制藥工藝概述第60頁 Insulin crystas 酸

31、醇提取法提取動(dòng)物胰島素生物制藥工藝概述第61頁注意事項(xiàng) 生物制藥工藝概述第62頁酶促半合成人胰島素生物制藥工藝概述第63頁重組DNA技術(shù)制造人胰島素 AB鏈合成法：以人工合成人胰島素A鏈和B鏈基因分別表示A鏈和B鏈，然后再組合起來。反轉(zhuǎn)錄酶法：經(jīng)過胰島素原cDNA合成，表示產(chǎn)物是胰島素原，經(jīng)工具酶切開，除去C-肽得人胰島素。生物制藥工藝概述第64頁Ins A鏈Ins B鏈轉(zhuǎn)化大腸桿菌發(fā)酵A鏈B鏈純化二硫鍵活性胰島素AB鏈合成人胰島素生物制藥工藝概述第65頁質(zhì)粒Ins mRNA反轉(zhuǎn)錄Ins cDNA轉(zhuǎn)化大腸桿菌PCR連接胰島素原活性胰島素二硫鍵酶切 提取質(zhì)粒限制性內(nèi)切酶酶切 反轉(zhuǎn)錄酶法合成人胰島

32、素生物制藥工藝概述第66頁核 酸 藥 物nucleic acid medicine生物制藥工藝概述第67頁依據(jù)化學(xué)結(jié)構(gòu)和組成份類：分四類核酸堿基及其衍生物1核苷及其衍生物2核苷酸及其衍生物3多核苷酸4生物制藥工藝概述第68頁生物制藥工藝概述第69頁生物制藥工藝概述第70頁依據(jù)結(jié)構(gòu)特點(diǎn)及臨床應(yīng)用情況分類含有天然結(jié)構(gòu)核酸類物質(zhì)如：肌苷、ATP、GTP、CTP、UTP、Co 等起源：提取或發(fā)酵特點(diǎn)：毒副作用小自然結(jié)構(gòu)堿基、核苷、核酸類結(jié)構(gòu)類似物如：巰嘌呤、阿糖胞苷、聚肌胞等起源：以核酸類物質(zhì)為前體經(jīng)過“化學(xué)法” 或“酶法”進(jìn)行半合成特點(diǎn)：毒性較大生物制藥工藝概述第71頁RNA生產(chǎn)工業(yè)用RNA提取RN

33、A制備含有生物活性RNA制備.生物制藥工藝概述第72頁1、工業(yè)用RNA提取稀堿法酵母等1NaOH裂解胞壁溶液HCL中和加熱破壞酶冷卻到10OC離心RNA溶液調(diào)pH2-2.5（靠近RNApl）離心RNA沉淀濃鹽法酵母等10NaCL90OC提取離心上清液調(diào)pH2-2.5離心RNA沉淀生物制藥工藝概述第73頁2、含有生物活性RNA制備生物制藥工藝概述第74頁從核糖核蛋白中分離RNA(1)乙醇沉淀法：核糖核蛋白溶于NaHCO3水相用含辛醇氯仿去蛋白乙醇RNA沉淀(2)鹽酸胍法：核糖核蛋白24鹽酸胍38OC溶解冷卻至0OC離心RNA沉淀生物制藥工藝概述第75頁 DNA生產(chǎn)方法1.工業(yè)用DNA提取生物制藥

34、工藝概述第76頁生物制藥工藝概述第77頁核苷酸制備水解法發(fā)酵法半合成法直接提取法.生物制藥工藝概述第78頁酶水解: DNA或RNA為原料制備5核苷酸常見酶：橘青霉產(chǎn)生5磷酸二酯酶橘青霉培養(yǎng)液壓濾酶液【酶解】除菌體DNA溶液酶解液加熱、調(diào)pH9.0過濾DNA降解液【離子交換】吸附于氯型陰離子樹脂分部洗脫脫氧核苷酸(dCMP、dAMP、dTMP、dGMP)RNA降解深入分離戊糖核苷酸生物制藥工藝概述第79頁堿水解：可制備3和2核苷酸生物制藥工藝概述第80頁發(fā)酵法生產(chǎn)核苷酸產(chǎn)氨短桿菌發(fā)酵生產(chǎn)肌苷酸（IMP）：腺嘌呤營(yíng)養(yǎng)缺點(diǎn)型嘌呤核苷酸生物合成路徑和代謝調(diào)控 R5PPRPPPRPP轉(zhuǎn)酰胺酶PRAIMP

35、分解腺嘌呤阻遏GMPAMPADPATP反饋抑制SAMPAMPADPATPXMPGMPGDPGTP鳥嘌呤PPGMPATPPRPPGTP次黃嘌呤鳥嘌呤GMP生物制藥工藝概述第81頁IMP積累主要路徑（前提）確保IMP合成路線通暢： 確保關(guān)鍵酶PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶活力-解除腺嘌呤及衍生物組遏和反饋抑制阻斷IMP去路： 阻斷SAMP合成 阻斷IMP分解篩選取得缺乏SAMP合成酶腺嘌呤缺點(diǎn)菌株，提供亞適量腺嘌呤。使積累IMP滲透到細(xì)胞外： 增大細(xì)胞膜通透性選育Mn2+不敏感變異株生物制藥工藝概述第82頁發(fā)酵法生產(chǎn)核苷生物制藥工藝概述第83頁枯草芽孢桿菌嘌呤核苷酸合成路徑SAMPAMPIMPGMPXMP345

36、678黃嘌呤缺點(diǎn)型（II）鳥嘌呤缺點(diǎn)型（經(jīng)誘變?nèi)笔?號(hào)酶）（III）鳥嘌呤缺點(diǎn)型（經(jīng)誘變?nèi)笔?號(hào)酶）腺嘌呤缺點(diǎn)型（經(jīng)誘變?nèi)笔?號(hào)或7號(hào)酶）AICARSAICARPRAPRPP21（一）（一）（一）（一）1：PRPP轉(zhuǎn)酰胺酶2、7：SAMP裂解酶3：IMP脫氫酶4：XMP氨化酶5：GMP還原酶6：SAMP合成酶8：AMP脫氫酶當(dāng)培養(yǎng)基中提供限量腺嘌呤時(shí) 積累IMP 肌苷 積累IMP 肌苷 積累XMP 黃苷 枯草桿菌磷酸單酯酶活力很強(qiáng)ADP（）生物制藥工藝概述第84頁酶類藥品生物制藥工藝概述第85頁酶分類生物制藥工藝概述第86頁生物制藥工藝概述第87頁生物制藥工藝概述第88頁酶類藥品提取和純化 原

37、料選擇生物材料預(yù)處理提取濃縮純化結(jié)晶生物制藥工藝概述第89頁動(dòng)物材料預(yù)處理：（1）機(jī)械法：有絞碎、刨碎、勻漿、研磨、超聲波、擠壓等方法， 有些酶用機(jī)械法處理后仍不能有效提取，可結(jié)合其 他處理法。（2）凍融： 冷到-10左右，再遲緩溶解至室溫，如此重復(fù)屢次。 因?yàn)榧?xì)胞中冰晶形成，及剩下液體中鹽濃度增高， 能使細(xì)胞中顆粒及整個(gè)細(xì)胞破碎，使酶釋放出來。（3）丙酮粉：組織經(jīng)丙酮快速脫水干燥制成丙酮粉，不但能夠降低 酶變性，同時(shí)因細(xì)胞結(jié)組成份破碎使蛋白質(zhì)與脂 質(zhì)結(jié)合一些化學(xué)鍵打開，促使一些結(jié)酶釋放到溶液中。材料預(yù)處理生物制藥工藝概述第90頁生物制藥工藝概述第91頁 酶濃縮（1）工業(yè)上：超濾、真空減壓濃縮

38、、薄膜濃縮、冷凍濃縮（2）試驗(yàn)室： 除上述方法外，對(duì)少許樣品可用以下方法 1. 用G-15或G-25濃縮 2. 用聚乙二醇濃縮生物制藥工藝概述第92頁注意兩個(gè)問題：1.建立快速測(cè)定酶活力方法 2.建立活力回收表酶純化：凡用于蛋白質(zhì)純化伎倆均適合用于酶純化從大腸桿菌中提取天冬酰胺酶活力回收表生物制藥工藝概述第93頁酶結(jié)晶 特征：有序性，對(duì)稱排列，周期性重復(fù)結(jié)構(gòu) 為空間結(jié)構(gòu)研究提供x-衍射樣品1.酶結(jié)晶方法 遲緩改變酶蛋白溶解度，使其略處于過飽和狀態(tài)。 （1）鹽析法 （2）有機(jī)溶劑沉淀法 （3）復(fù)合結(jié)晶法 （4）透析平衡法 （5）等電點(diǎn)法既是純化結(jié)果又是純化伎倆生物制藥工藝概述第94頁2.結(jié)晶條件

39、選擇酶純度酶濃度金屬離子pH溫度、時(shí)間晶種生物制藥工藝概述第95頁 酶分離純化工作中注意事項(xiàng)1. 預(yù)防酶蛋白變性2. 預(yù)防復(fù)因子丟失3. 預(yù)防酶被蛋白 水解酶降解生物制藥工藝概述第96頁超氧化物歧化酶（Superoxide dismutase, SOD）結(jié)構(gòu)特點(diǎn)：金屬酶Fe-SOD: Mw38000，2個(gè)亞基，每個(gè)亞基含1個(gè)Fe，存在 于 中 Cu、Zn-SOD: Mw3，2個(gè)亞基，每個(gè)亞基含1個(gè)Cu，1個(gè) Zn，存在于 中Mn-SOD: 原核細(xì)胞中，Mw40000,2個(gè)亞基，每個(gè)亞基1個(gè)Mn 真核細(xì)胞中，Mw80000，4個(gè)亞基，每個(gè)亞基1個(gè)Mn真核細(xì)胞原核細(xì)胞生物制藥工藝概述第97頁酶性質(zhì)

40、穩(wěn)定性 對(duì)熱穩(wěn)定：天然牛血SOD可75加熱數(shù)分鐘，對(duì)熱 穩(wěn)定性與溶液離子強(qiáng)度相關(guān) 對(duì)pH穩(wěn)定性：普通pH5.39.5較穩(wěn)定，豬血SOD在 pH7.69較穩(wěn)定金屬輔基與酶活性關(guān)系 Cu、Zn-SOD：Zn與分子結(jié)構(gòu)相關(guān)，與催化活性無關(guān) Cu與活性相關(guān)，對(duì)酶活力是必需 Mn-SOD：Mn對(duì)酶活力是必需 Fe-SOD：Fe對(duì)酶活力是必需生物制藥工藝概述第98頁1.以牛血紅細(xì)胞提取Cu、Zn-SOD工藝生物制藥工藝概述第99頁2.以牛肝為原料提取Mn-SOD工藝生物制藥工藝概述第100頁糖科學(xué)蛋白 核酸糖類生物化學(xué)最終巨大前沿之一生物制藥工藝概述第101頁生物制藥工藝概述第102頁Text1Text3

41、Txt5植物動(dòng)物微生物海藻多糖分類（按照其起源不一樣來分）生物制藥工藝概述第103頁多糖在細(xì)胞內(nèi)存在方式游離型結(jié)合型:糖蛋白，如人參多糖、黃芪多糖等脂多糖，如胎盤脂多糖、細(xì)菌脂多糖等。生物制藥工藝概述第104頁多糖類藥品藥理活性抗氧化 調(diào)整血糖血脂 抗輻射損傷抗?jié)冋{(diào)整免疫功效抗病毒 抗突變 抗衰老抗腫瘤抗凝血 生物制藥工藝概述第105頁我國已經(jīng)上市多糖藥品產(chǎn)品名稱生產(chǎn)單位產(chǎn)品類別適應(yīng)癥香菇多糖金陵藥業(yè)股份有限企業(yè)福州梅峰制藥廠中藥惡性腫瘤輔助治療靈孢多糖注射液北京協(xié)和藥廠化學(xué)藥品用于治療神經(jīng)官能癥、多發(fā)性肌炎、皮肌炎、萎縮性肌強(qiáng)直與進(jìn)行性肌營(yíng)養(yǎng)不良以及因免疫功效所致各種疾病。紫芝多糖片江西大茅制藥有限責(zé)任企業(yè)中藥用于神經(jīng)衰弱，白細(xì)胞和