醫(yī)學(xué)免疫學(xué)課件：標(biāo)記免疫技術(shù)－基本概念

1、免疫技術(shù)：以抗原-抗體反應(yīng)原理為基礎(chǔ)，對樣品中相應(yīng)抗原或抗體進(jìn)行檢測。（高度特異性） 標(biāo)記技術(shù)：將可被探測的示蹤物質(zhì)用化學(xué)方法與化合物連接。（如熒光素、放射性核素、酶、化學(xué)或生物發(fā)光劑等） 標(biāo)記免疫技術(shù)：用可微量或超微量檢測的示蹤劑標(biāo)記抗原/抗體，檢測免疫反應(yīng)結(jié)果并確定待檢物。 (高度特異性和高度靈敏性的有機(jī)結(jié)合)標(biāo)記免疫技術(shù)基本概念2免疫技術(shù)試劑標(biāo)本AgAbAbAg3標(biāo)記免疫技術(shù)試劑標(biāo)本Ag*AbAb*Ag放射性核素?zé)晒馑孛富瘜W(xué)發(fā)光劑膠體金標(biāo)記物技術(shù)放射性核素放射免疫技術(shù)熒光素?zé)晒饷庖呒夹g(shù)酶酶免疫技術(shù)化學(xué)發(fā)光劑化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù)膠體金免疫金技術(shù) 標(biāo)記免疫技術(shù)的分類： 免疫組化技術(shù) 總體 免疫測

2、定技術(shù) 按是否使用 放射性免疫測定 放射性核素 非放射性免疫測定 按測定反應(yīng)體 均相免疫測定 固相免疫測定 系的物理狀態(tài) 非均相免疫測定 液相免疫測定 放射免疫技術(shù) 酶免疫技術(shù) 按示蹤物 熒光免疫技術(shù) 化學(xué)發(fā)光免疫技術(shù) 免疫金標(biāo)記技術(shù) 三大經(jīng)典的標(biāo)記免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù) 放射免疫技術(shù)酶免疫技術(shù)熒光免疫技術(shù)是將抗原抗體反應(yīng)與熒光技術(shù)相結(jié)合而建立的一種免疫標(biāo)記技術(shù)，具有高度特異性、敏感性和直觀性。熒光免疫技術(shù)是最早出現(xiàn)的免疫標(biāo)記技術(shù)。經(jīng)典的熒光免疫技術(shù)是以熒光素標(biāo)記抗體對抗原進(jìn)行定位染色，并借助熒光顯微鏡觀察標(biāo)本片上熒光染色形態(tài)，從而判斷是否存在待測抗原-熒光抗體技術(shù)。然后才進(jìn)一步發(fā)展出熒光免疫分

3、析技術(shù)，可對液體中的抗原、抗體進(jìn)行自動(dòng)化定量檢測。7熒光抗體技術(shù)直接法 間接法 直接法:每檢測一種抗原必須制備相應(yīng)的熒光抗體間接法:敏感性比直接法高,制備一種熒光二抗可用于多種抗原的檢測放射免疫技術(shù)始創(chuàng)于1959年Yalow和Berson用放射性核素標(biāo)記胰島素，常用于各種激素、微量蛋白質(zhì)、腫瘤標(biāo)志物和藥物等微量物質(zhì)的測定。開創(chuàng)了體液微量物質(zhì)定量分析的嶄新領(lǐng)域，并為其他標(biāo)記免疫分析的建立和發(fā)展奠定了基礎(chǔ)。 但由于放射污染和危害，常用核素半衰期短，試劑盒穩(wěn)定期不長等諸多不足, 放免將逐漸被取代。9放射免疫測定法(RIA)示意圖 Ag* Ab Ag 標(biāo)記抗原 特異性抗體 待測抗原( Ag*-Ab)+

4、 (Ag-Ab) 抗原抗體復(fù)合物分離Ag*-Ab 和游離Ag*從標(biāo)準(zhǔn)曲線上讀知含量測定Ag*-Ab和/或游離Ag*放射性 20世紀(jì)70年代初人們利用酶標(biāo)記抗體或抗原作為主要試劑，創(chuàng)立了酶免疫分析，其后又衍生出酶免疫組織化學(xué)技術(shù)，兩者統(tǒng)稱為酶免疫技術(shù)。酶免疫技術(shù)酶免疫組化酶免疫測定均 相非均相固相酶免疫測定液相酶免疫測定組織切片或其它標(biāo)本中抗原的定位 液體標(biāo)本中抗原或抗體的定性和定量用于小分子激素和半抗原（如藥物）的測定 酶標(biāo)記物與相應(yīng)的抗原或抗體結(jié)合后，標(biāo)記酶的活性會(huì)發(fā)生改變，不用分離結(jié)合和游離酶標(biāo)記物，通過測定標(biāo)記酶的活性的改變，而確定抗原或抗體的含量。原理均相酶免疫測定分類：液相酶免疫測定

5、 固相酶免疫測定 以聚苯乙烯等材料作為固相載體的酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA） 是目前最為常用的固相酶免疫測定與均相不同之處需分離游離與結(jié)合的酶標(biāo)記物非均相酶免疫測定14酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)用酶標(biāo)記Ab(或Ag)與標(biāo)本中的Ag(或Ab)發(fā)生特異性結(jié)合加入酶的底物，在酶作用下產(chǎn)生有色物質(zhì),根據(jù)顏色可作出判斷或測量光密度值+雙抗體夾心法(檢測抗原)均相酶免疫測定主要用于藥物和小分子物質(zhì)的檢測。非均相免疫測定中的ELISA應(yīng)用更為廣泛，ELISA廣泛用于傳染病的診斷，病毒如病毒性肝炎（甲肝抗體、“乙肝二對半”、丙肝抗體、丁肝抗體、戊肝抗體）、風(fēng)疹病毒、皰疹病毒、輪狀病毒等；細(xì)菌如結(jié)核桿菌、

6、幽門螺桿菌等。也用于一些蛋白質(zhì)檢測，如各種免疫球蛋白、補(bǔ)體、腫瘤標(biāo)志物（甲胎蛋白、癌胚抗原、前列腺特異性抗原等）。發(fā)光免疫分析:是將發(fā)光分析和免疫反應(yīng)相結(jié)合而建立起來的一種新的檢測微量抗原或抗體的新型標(biāo)記免疫分析技術(shù)。化學(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的類型化學(xué)發(fā)光酶免疫分析: 用酶標(biāo)記抗原或抗體，免疫反應(yīng)后，酶催化發(fā)光底物，引發(fā)發(fā)光。（直接）化學(xué)發(fā)光免疫分析: 化學(xué)發(fā)光物質(zhì)直接標(biāo)記抗原或抗體，免疫反應(yīng)后引發(fā)化學(xué)發(fā)光。 電化學(xué)發(fā)光免疫分析： 電化學(xué)發(fā)光劑標(biāo)記抗原或抗體，免疫反應(yīng)后引發(fā)電化學(xué)發(fā)光?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析技術(shù)的類型標(biāo)記物底物原理檢測信號均相/非均相推出年代堿性磷酸酶金剛烷LEIA光強(qiáng)度非均相19904

7、-MUPLEIA光強(qiáng)度非均相1992辣根過氧化物酶魯米諾LEIA光強(qiáng)度非均相1989吖啶酯無CLIA光強(qiáng)度非均相1990三聯(lián)吡啶釕無ECL電激發(fā)強(qiáng)度非均相199070年代中期，Arakaweu首次報(bào)道用發(fā)光信號進(jìn)行酶免分析，利用發(fā)光的化學(xué)反應(yīng)分析超微量物質(zhì)，將酶免疫分析和化學(xué)發(fā)光相結(jié)合； 1981年P(guān)annagli等建立化學(xué)發(fā)光免疫分析（CLIA，chemiluminescence immunoassay）；1984年 Whitehead等首次在發(fā)光免疫分析系統(tǒng)中加入熒光素為發(fā)光增強(qiáng)劑，極大的提高了CLIA的敏感性；但當(dāng)時(shí)這種方法也存在明顯的不足，如：發(fā)光持續(xù)時(shí)間短，衰減快，僅為數(shù)秒，影響因素

8、多，故停留在實(shí)驗(yàn)室階段。 進(jìn)入90年代中期發(fā)展起全自動(dòng)化學(xué)發(fā)光免疫分析儀，實(shí)現(xiàn)了分析自動(dòng)化，加上CLIA的敏感性高（可達(dá)10-18mol）、快速、幾秒鐘內(nèi)產(chǎn)生化學(xué)發(fā)光信號信息量大，持續(xù)時(shí)間長、可達(dá)數(shù)小時(shí)，而得到廣泛的應(yīng)用，從而成為非放射免疫分析中最有前途的方法?；瘜W(xué)發(fā)光免疫分析作為一種非放射性免疫標(biāo)記技術(shù)，除了具有靈敏、特異、標(biāo)記物穩(wěn)定、重復(fù)性好等特點(diǎn)外，還具有操作簡便、快速、標(biāo)本需要量少、可實(shí)現(xiàn)自動(dòng)化等，因此，近年來檢測范圍不斷擴(kuò)大，臨床上已應(yīng)用于以下方面的檢測：甲狀腺激素、生殖激素、垂體激素和皮質(zhì)激素、貧血因子、腫瘤標(biāo)志物、感染性疾病、糖尿病如 胰島素、血清C-肽、血漿胰高糖素等、心臟標(biāo)志

9、物、病毒標(biāo)記物、過敏性疾病、治療藥物監(jiān)測等。免疫金標(biāo)記技術(shù)(Immunogold labelling techique)生物素-親和素系統(tǒng)（BAS）是20世紀(jì)70年代末發(fā)展起來的一種新型生物反應(yīng)放大系統(tǒng)。生物素-親和素系統(tǒng)具有高親和力和多級放大效應(yīng)，既能偶聯(lián)抗原（或抗體）分子，又能偶聯(lián)酶、熒光素等示蹤物質(zhì)，因此可橋聯(lián)抗原抗體系統(tǒng)和示蹤物質(zhì)指示系統(tǒng)，賦予傳統(tǒng)標(biāo)記免疫分析更高的檢測敏感度。BAS可應(yīng)用于固相載體的包被環(huán)節(jié)，以實(shí)現(xiàn)某些抗原與固相載體的連接，并可減少抗體的空間位阻。熒光抗體技術(shù)、放射免疫分析和酶免疫技術(shù)-三大經(jīng)典標(biāo)記免疫技術(shù)。首先被用作標(biāo)記免疫技術(shù)中的標(biāo)記物是熒光素。1941年Coons建立的熒光抗體技術(shù)使組織和細(xì)胞中抗原物質(zhì)的定位成為可能。放射性核素作為標(biāo)記物在免疫技術(shù)中的應(yīng)用又開創(chuàng)了特異性的超微量免疫測定。1956年Yalo