分子生物實驗課件：斑點雜交三_第1頁
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文檔簡介

1、斑點印跡雜交 掌握斑點印跡雜交的原理及方法 實驗目的雜交：具有一定同源性的兩條核酸單鏈在一定條件下（適宜的溫度及離子強度等）可按堿基互補原則形成雙鏈，此雜交過程是高度特異的。雜交的雙方是待測核酸及探針。斑點雜交：是指將待測的DNA變性后點加在硝酸纖維素膜（或尼龍膜）上，用已標記的探針進行雜交，洗膜（除去未結(jié)合的探針），顯影，判斷是否有雜交或其雜交強度，主要用于基因缺失或拷貝數(shù)改變的檢測。根據(jù)點樣磨具不同，點樣形狀呈圓形稱為斑點雜交，呈狹縫形則稱為狹縫雜交。實驗原理 斑點印跡雜交不需要電泳和轉(zhuǎn)移，雜交過程包括變性，點樣，中和，干燥固定，預雜交，雜交，封閉，檢測雜交結(jié)果等步驟，相對southern

2、印跡雜交和Northern印記雜交來說快，適合于同時分析多個樣品。實驗步驟：變性：按8:1將80ul ddH2O加入至10ul待測DNA樣品中，稀釋樣品。100加熱10min后，立即置于冰中5min（使DNA變性），加入90ul 20SSC混勻。點樣：將上述變性后的樣品180ul點在尼龍膜的毛面上，真空抽濾，室溫下風干后，于烤箱中120烘烤15min。使變性的DNA與膜結(jié)合牢固預雜交：將膜放入15ml離心管中，做好剪角標記（剪H角，剪角位于左下角時為正）。加入預雜交液3ml。置42恒溫搖床上，輕輕振搖30min。封閉雜交膜上多余的非特異性DNA結(jié)合位點雜交：將5UL探針（生物素-DNA）加入預

3、雜交液中，置42 恒溫床上，輕輕振蕩1h。變性DNA與探針結(jié)合5 洗膜：倒掉雜交液，洗液1(每次5ml）洗膜三次（洗液1預熱到42），每次5min；再將洗液2 (每次5ml）洗膜兩次（預熱到42），每次15min。洗去未結(jié)合的探針，否則本底會太高6 封閉：倒掉洗液2，加入5ml封閉液，37作用15min。封閉雜交膜上非特異性的蛋白結(jié)合位點7 酶聯(lián)抗體結(jié)合：倒掉封閉液，加入3ml親和素-辣根過氧化物酶（HRP），于37輕輕振搖30min。酶聯(lián)抗體與生物素結(jié)合8 洗膜：倒掉第七步驟中液體，加入5ml洗液3，洗膜三次，每次2-3min。洗去未結(jié)合的酶聯(lián)抗體9 顯色：洗膜后，加3ml的顯色液避光顯色1-2min，斑點出來后就可倒掉顯色液，用ddH20沖洗幾次，終止顯色。A4A5A6B4B5C4C5D4D5E4E5F4F5G4G5H

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