分子生物學(xué)檢驗(yàn)：重組質(zhì)粒DNA的提取

1、重組質(zhì)粒DNA的提取目的：1.掌握堿裂解法的原理 2.掌握重組質(zhì)粒DNA的提取方法和操作原理：堿變性抽提質(zhì)粒DNA是基于染色體DNA與質(zhì)粒DNA的變性與復(fù)性的差異而達(dá)到分離的目的。在PH高達(dá)12.6的堿性條件下，染色體DNA的氫鍵斷裂，雙螺旋結(jié)構(gòu)解開而變性。質(zhì)粒DNA的大部分氫鍵也斷裂，但超螺旋共價(jià)閉合環(huán)狀的兩條互補(bǔ)鏈不會完全分離，當(dāng)以PH4.8的緩沖液NaAc/KAc調(diào)至PH至中性時(shí)，只有變性質(zhì)?？蓮?fù)性，通過離心，可與其他物質(zhì)分離。器材與試劑：微量加樣槍，高速離心機(jī)，恒溫振蕩搖床，蒸汽消毒器，渦旋振蕩器，恒溫水浴鍋，雙蒸水器，冰箱，Takara質(zhì)粒抽提試劑盒標(biāo)本：含PUC119+U6的大腸桿

2、菌操作：1.從平板上挑取單菌落接種至1-4ml的含有抗生素的液體培養(yǎng)基中，37 ，150rpm/h過夜培養(yǎng)，時(shí)間大概14-16小時(shí)2.取1.5ml培養(yǎng)液至1.5ml離心管中，12000rpm/s ，離心2min,棄上清。3.用250ul的Solution （含RNase A）充分懸浮細(xì)菌沉淀（注：不要?dú)埩艏?xì)小菌塊，可以振蕩懸?。?.加入250ul的Solution輕輕上下翻轉(zhuǎn)混合5-6次，使菌體充分裂解，形成透明溶液（注：不可振蕩，時(shí)間短于min）操作5.加入350ul的4預(yù)冷的Solution，輕輕上下翻轉(zhuǎn)混合5-6次，直至形成緊實(shí)凝塊，然后室溫靜置2min6.室溫12000rpm/s離心1

3、0min（此時(shí)4 不利于沉淀降解）7.將試劑盒中的Spin Column安置于Collection Tube上8.將500ul的Buffer BL加入Spin Column中， 12000rpm/s離心1min，棄濾液9.將操作步驟6的上清液轉(zhuǎn)移至Spin Column中，12000rpm/s離心1min，棄濾液操作10.將500ul的Buffer WA加入Spin Column中，12000rpm/s離心30sec，棄濾液11.將700ul的Buffer WB加入Spin Column中，12000rpm/s離心30sec，棄濾液12.重復(fù)步驟1113.重新將Spin Column 安置于C

4、ollection Tube上，12000rpm/s離心1min，除盡殘留液14.將Spin Column 安置于新的離心管上，加入80ul Elution Buffer,室溫靜置2min（Elution Buffer預(yù)熱至60）15. 12000rpm/s離心1min洗脫DNA質(zhì)粒DNA的酶切電泳鑒定目的：1.掌握質(zhì)粒DNA的酶切電泳 2.熟悉重組體的鑒定方法原理：通過酶切（雙酶切法對質(zhì)粒DNA進(jìn)行酶切，然后用電泳鑒定酶切產(chǎn)物的純度）器材與試劑：恒溫水浴箱，微量加樣槍，凝膠電泳裝置，凝膠成像儀，EP管，BamHI,Hind,10M緩沖液，ddH2O,Goldview染料，瓊脂糖標(biāo)本：質(zhì)粒PUC119,PUC(119-U6)操作：BamHI和Hind雙酶切,反應(yīng)體系： PUC119 PUC(119-U6)質(zhì)粒 12 12BamHI 1.5 1.5E.coliR 1.5 1.510M緩沖液 2.5 2.5ddH2O 2.5 2.5總體積 20 20操作：37 下酶切2h,0.8-1.0%瓊脂糖凝膠電泳質(zhì)粒DNA和酶切產(chǎn)物，凝膠成像儀下觀察結(jié)果思考除限制性內(nèi)切酶鑒定重組體外，還有哪些方法？1.藍(lán)