基因工程技術的基本工具

1、專題1基因工程基因的內(nèi)涵基因是具有遺傳效應的DNA片段DNA分子的結(jié)構磷酸二酯鍵特點：（1）兩條脫氧核苷酸鏈反向平行盤旋成雙螺旋結(jié)構（2）脫氧核糖和核酸交替連接，排列在外側(cè)，構成基本骨架（3）兩條鏈上的堿基通過氫鍵連接排列在內(nèi)測原核細胞的基因結(jié)構(補充內(nèi)容）非編碼區(qū)非編碼區(qū)編碼區(qū)編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 與RNA聚合酶結(jié)合位點啟動子終止子不編碼蛋白質(zhì)。：編碼蛋白質(zhì) ,連續(xù)不間斷編碼區(qū)非編碼區(qū)原核細胞的 基因結(jié)構調(diào)控遺傳信息表達,上 游有啟動子，下游有終止子啟動子真核細胞的基因結(jié)構（補充內(nèi)容）編碼區(qū)非編碼區(qū)非編碼區(qū)與RNA聚合酶結(jié)合位點內(nèi)含子 外顯子 啟動子終止子編碼區(qū)上游 編碼區(qū)下游 真核細胞的

2、 基因結(jié)構編碼區(qū)非編碼區(qū)外顯子：能編碼蛋白質(zhì)的序列內(nèi)含子：不能編碼蛋白質(zhì)的序列：有調(diào)控作用,上游有啟動子，下游有終止子非編碼序列：包括非編碼區(qū)和內(nèi)含子基因工程的產(chǎn)物轉(zhuǎn)基因大腸桿菌轉(zhuǎn)基因小鼠轉(zhuǎn)基因煙草基因工程什么叫基因工程？ 基因工程是指按照人們的愿望，進行嚴格的設計，并通過體外DNA重組和轉(zhuǎn)基因等技術，賦予生物以新的遺傳特性，從而創(chuàng)造出更符合人們需要的新的生物類型和生物產(chǎn)品。由于基因工程是在DNA分子水平上進行設計和施工的，因此又叫做DNA重組技術。對基因工程概念的理解基因重組生物體外基因/DNA分子水平剪切拼接導入表達人類需要的基因產(chǎn)物克服了遠緣雜交不親和的障礙定向改造生物性狀問題探討：蘇云

3、金芽孢桿菌含有一種可以合成毒蛋白的基因。讓細菌的毒蛋白基因在棉花細胞中表達，可培育出抵抗棉鈴蟲害的抗蟲棉。想一想需要做哪些關鍵工作？蘇云金芽孢桿菌毒蛋白普通棉花抗蟲棉基因工程培育抗蟲棉的關鍵步驟：關鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細胞內(nèi)提取出來關鍵步驟二：抗蟲基因與棉花DNA“縫合”關鍵步驟三：抗蟲基因進入棉花細胞解決培育抗蟲棉的關鍵步驟需要哪些工具？“分子手術刀” 限制性核酸內(nèi)切酶關鍵步驟一：抗蟲基因從蘇云金芽孢桿菌細胞內(nèi)提取出來關鍵步驟二：抗蟲基因與棉花DNA“縫合”關鍵步驟三：抗蟲基因進入棉花細胞“分子縫合針” DNA連接酶“分子運輸車” 基因進入受體細胞的載體1.1、DNA重組技術的

4、基本工具一、限制性核酸內(nèi)切酶“分子手術刀” 限制酶分布在哪里？有何特點？斷開的是什么化學鍵？作用結(jié)果怎樣？磷酸二酯鍵ATGGCATCTTCGAA氫鍵主要從原核生物中分離純化出來 1、來源： 2、特點：3、作用：4、結(jié)果：具有專一性識別某種特定的核苷酸序列，使特定部位的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵切開形成兩種末端黏性末端平末端切開磷酸二酯鍵限制性內(nèi)切酶限制酶EcoRSma平末端平末端G A A T T C C T T A A G 中軸線C T T A A G A A T T C G C C C G G G G G G C C C C C C G G G G G G C C C 黏性末端平末端切割D

5、NA分子時產(chǎn)生的兩種不同末端限制酶的識別序列：能被限制性內(nèi)切酶特異性識別的切割部位都具有回文序列：在切割部位，一條鏈正向讀的堿基順序與另一條鏈反向讀的順序完全一致。尋根問底你能推測限制酶存在于原核生物中的作用是是什么嗎？ 原核生物易受自然界外源DNA的入侵，但生物在長期的進化過程中形成了一套完善的防御機制，以防止外來病原物的侵害。限制酶就是細菌的一種防御性工具，當外源DNA侵入時，會利用限制酶將外源DNA切割掉，以保證自身的安全。所以，限制酶在原核生物中主要起到切割外源DNA、使之失效，從而達到保護自身的目的。思考與探究 P7 （2）為什么限制酶不剪切細菌本身的DNA？ 通過長期的進化，細菌中

6、含有某種限制酶的細胞，其DNA分子中或者不具備這種限制酶的識別切割序列；或者通過甲基化酶將甲基轉(zhuǎn)移到所識別序列的堿基上，使限制酶不能將其切開。這樣，盡管細菌中含有某種限制酶也不會使自身的DNA被切斷，并且可以防止外源DNA的入侵。 限制性內(nèi)切酶與DNA解旋酶的區(qū)別切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯鍵將DNA兩條鏈的氫鍵打開形成兩條單鏈限制性內(nèi)切酶與DNA水解酶的區(qū)別切割特定的核苷酸序列的磷酸二酯鍵，形成片段的DNA.切割磷酸二酯鍵，形成單個的脫氧核苷酸。二、DNA連接酶“分子縫合針”1、作用：恢復被限制酶切開的兩個核苷酸之間的磷酸二酯鍵E.coliDNA連接酶：連接黏性末端T4DNA連接酶：連接黏

7、性末端和平末端(效率較低)2、種類：形成磷酸二酯鍵GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGEcoRGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG不同來源的DNA片段混合將不同種來源的DNA片段連接起來生物A基因片段生物B基因片段GAATTCCTTAAG酶切GAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAGGAATTCCTTAAG同一種DNA連接酶與DNA聚合酶是一回事嗎?為什么?1)只能將單個核苷酸連接到已有的核酸片段上，形成磷酸二酯鍵形成磷酸二酯鍵1)在兩個DNA片段之間形成磷酸二酯鍵2)以一條DNA鏈為模板，將單個核苷酸通過磷酸二酯鍵連接成一條互補的DNA鏈2)將DNA雙鏈上的兩個

8、缺口同時連接起來，不需要模板三、基因進入受體細胞的運載體“分子運輸車”1、常用的運載體：質(zhì)粒、 噬菌體衍生物、動植物病毒等質(zhì)粒：主要存在于細菌等微生物體內(nèi)。獨立于擬核或染色 體DNA外的能進行自我復制的小型環(huán)狀DNA分子大腸桿菌及質(zhì)粒載體結(jié)構模式圖運載體需具備的四個條件：有一至多個不同的限制酶切點，供外源DNA片段（基因）插入其中具有某些特殊的標記基因，如四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇能在宿主細胞內(nèi)復制并穩(wěn)定地保存注意：在基因工程操作中，運載體都是天然的質(zhì)粒或病毒經(jīng)過人工改造的小結(jié)基因工程的工具限制酶主要存在于原核生物中具有專一性(識別序列)切開DNA分

9、子的磷酸二酯鍵DNA連接酶連接磷酸二酯鍵種類E.coliDNA連接酶T4 DNA連接酶運載工具條件能自我復制具多個限制酶切位點具標記基因等質(zhì)粒、噬菌體衍生物、動植物病毒等3、天然的DNA分子可以直接用做基因工程載體嗎？為什么？提示： 基因工程中作為載體使用的DNA分子大多都是質(zhì)粒（plasmid），即獨立于細菌擬核染色體DNA之外的一種可以自我復制、雙鏈閉環(huán)的裸露的DNA分子。 是否任何質(zhì)粒都可以作為基因工程載體使用呢？ 不是，作為基因工程使用的載體必需滿足以下條件：思考與探究 P7 能在宿主細胞內(nèi)復制并穩(wěn)定地保存 有一至多個不同的限制酶切點，供外源DNA片段（基因）插入其中 具有某些特殊的標記基因，如四環(huán)素抗性基因、氨芐青霉素抗性基因等標記基因，供重組DNA的鑒定和選擇實際上自然存在的質(zhì)粒DNA分子并不完全具備上述條件，都要進行人工改造后才能用于基因工程操作。4、DNA連接酶有連接單鏈DNA的本領嗎？ 迄今為止，所發(fā)現(xiàn)的DNA連接酶都不具有連接單鏈DNA的能力，至于原因，現(xiàn)在還不清楚，也許將來會發(fā)現(xiàn)可以連接單鏈DNA的酶。思考與探究 P7隨堂練習：1、關于限制酶的說法中，正確的是（ ）A、限制酶是一種酶，只識別GAATTC堿基序列B、EcoRI切割的是GA之間的氫鍵C限制酶一般不切割自身的DNA分子，只切割外源DNAD限制酶只存在于原核生物中答案：C2. （多選）有關基