應(yīng)用siRNA技術(shù)下調(diào)survivin基因表達(dá)以增強(qiáng)SGC7901胃癌細(xì)胞對順鉑

1、應(yīng)用siRNA技術(shù)下調(diào)survivin基因表達(dá)以增強(qiáng)SGC7901胃癌細(xì)胞對順鉑【摘要】目的利用小干擾RNA(siRNA)技術(shù)特異性下調(diào)survivin基因的表達(dá)，檢測SG7901胃癌細(xì)胞轉(zhuǎn)染前后對順鉑敏感性的變化。方法實(shí)驗(yàn)分為空白對照組(ntrl組)、單用順鉑組(DDP組)、脂質(zhì)體組(Lip組)、單用survivinsiRNA組(siRNA組)、轉(zhuǎn)染survivinsiRNA(轉(zhuǎn)染組)及轉(zhuǎn)染survivinsiRNA結(jié)合順鉑作用組(結(jié)合作用組)。人工合成survivinsiRNA，通過Lip包裹將siRNA轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SG7901，熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染情況。TT法檢測各組細(xì)胞的增殖抑制率，e

2、sternblt及免疫細(xì)胞化學(xué)法檢測survivin蛋白的表達(dá)，Hehst染色觀察細(xì)胞凋亡的形態(tài)改變。結(jié)果Hehst染色熒光顯微鏡下ntrl組、Lip組及siRNA組細(xì)胞核呈正常的藍(lán)色,而DDP組、轉(zhuǎn)染組及結(jié)合作用組細(xì)胞核染色增強(qiáng)、核質(zhì)濃縮、核碎裂,呈凋亡改變;結(jié)合作用組細(xì)胞增殖抑制率(63.934.22)%明顯高于其余各組(P0.05);轉(zhuǎn)染組及結(jié)合作用組survivin蛋白表達(dá)明顯低于其他各組(P0.05)。結(jié)論應(yīng)用siRNA技術(shù)下調(diào)SG7901胃癌細(xì)胞中survivin基因的表達(dá)，可以增加其對順鉑的藥物敏感性?！娟P(guān)鍵詞】survivin;siRNA;胃癌;順鉑Abstrat:bjetiv

3、eTdetetthevariatinsinisplatinsensitivityfhuangastriarinaelllineSG7901befreandaftertransfetintspeifiallydnregulatetheexpressinfsurvivinggeneithsallinterferingRNA(siRNA)tehnlgy.ethdsThisexperientisdividedintthentrlgrup,isplatingrup(DDPgrup),lipsegrup(lipgrup),siRNAgrup,transfetingrupandsiRNAbinedDDPgr

4、up(binedgrup).SurvivinsiRNAasartifiiallysynthesizedandthentransfetedintgastrianerellsithlipse.Thetransfetineffetseredeterinedbyflureseneirspy.TheinhibitryratefellprliferatinasassayedbyTT,andtheexpressinfsurvivinprtEinasdeterinedbyesternbltandiunytheialstaining.Therphlgialhangesftheappttiellserebserv

5、edbyHehststaining.ResultsAsbservedundertheflureseneirspeafterHehststaining,thenulEIpresentedasnralblueinthentrlgrup,lipgrupandsiRNAgrup,hileDDPgrup,siRNAtransfetingrupandsiRNAbinedisplatingruphadsuhhangesasreinfrednulearstaining,karypyknsisandkaryrrhexisithappttihanges.Theinhibitinratefellprliferati

6、ninsiRNAbinedisplatingrup(63.934.22)%asarkedlyhigherthanthethergrups(P0.05).parediththergrups,theexpressinfsurvivinprteininthetransfetingrupandsiRNAbinedisplatingrupassignifiantlyredued,andthediffereneshadstatistialsignifiane(P0.05).nlusinTheappliatinfsiRNAtehnlgytdnregulatethesurvivingeneexpressinf

7、huangastriarinaelllineSG7901isabletenhaneitsdrugsensitivitytisplatin.Keyrds：survivin;siRNA;gastriarina;isplatin順鉑是目前臨床上最常用的化療藥物之一,其抗腫瘤作用明顯、價(jià)格低廉，并且可應(yīng)用于多種腫瘤的化療,但是長期應(yīng)用后極易出現(xiàn)耐受現(xiàn)象，降低其療效,并且隨著劑量的增加，出現(xiàn)的副作用越來越多。有研究說明,長期應(yīng)用順鉑后，某些腫瘤細(xì)胞中出現(xiàn)耐藥現(xiàn)象并且可檢測到存活素(survivin)的高表達(dá)1。survivin是近年新發(fā)現(xiàn)的一種凋亡抑制因子，具有強(qiáng)大的抗凋亡功能，屬于凋亡抑制因子(inh

8、ibitrfapptsisprteins，IAP)家族成員之一。survivin與胃癌的定量研究說明，其表達(dá)量與患者的預(yù)后呈負(fù)相關(guān)。分化程度越低的胃癌組織中survivin表達(dá)率越高，患者預(yù)后越差2。因此，本實(shí)驗(yàn)通過將人工合成的survivin小干擾RNA(siRNA)經(jīng)脂質(zhì)體(lipse,Lip)包裹后轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞SG7901，討論特異性地降低胃癌細(xì)胞SG7901中survivin的表達(dá)能否增強(qiáng)該細(xì)胞對順鉑的化療敏感性，從而為胃癌的化療開拓一條新途徑。1材料和方法1.1材料1.1.1主要試劑RPI1640購自美國GIB公司;胎牛血清(FBS)為杭州四季青公司產(chǎn)品;LipfetaineT200

9、0試劑盒及PTIEN轉(zhuǎn)染液為Invitrgen公司產(chǎn)品，兔抗人survivin多克隆抗體購于Santaruz公司，四甲基偶氮唑藍(lán)(TT)購自Siga公司，順鉑購自江蘇豪森藥業(yè)公司，稀釋于RPI1640培養(yǎng)液中，終濃度為1g/L。1.1.2細(xì)胞株人胃癌細(xì)胞株SG7901，由徐州醫(yī)學(xué)院病理學(xué)教研室保存。1.2方法1.2.1實(shí)驗(yàn)分組及細(xì)胞轉(zhuǎn)染實(shí)驗(yàn)分為空白對照組(ntrl組)、單用順鉑組(DDP組)、Lip組、單用survivinsiRNA組(siRNA組)、轉(zhuǎn)染survivinsiRNA(轉(zhuǎn)染組)及轉(zhuǎn)染survivinsiRNA結(jié)合順鉑作用組(結(jié)合作用組)，每組設(shè)4個(gè)復(fù)孔。各組作用SG7901細(xì)胞7

10、2h后進(jìn)展相應(yīng)后續(xù)試驗(yàn)。人胃癌細(xì)胞SG7901常規(guī)培養(yǎng)至細(xì)胞交融約40%70%時(shí)進(jìn)展轉(zhuǎn)染。用ptie分別稀釋脂質(zhì)體和survivinsiRNA至試驗(yàn)所需濃度并輕輕混勻，5in后將survivinsiRNA稀釋液與Lip稀釋液混勻，并在室溫下放置30in使之充分結(jié)合，參加細(xì)胞中，輕輕搖擺。375%2溫箱中培養(yǎng)，46h后吸出，參加含10%FBS的RPI1640培養(yǎng)液。繼續(xù)培養(yǎng)48h后即可用于后續(xù)試驗(yàn)。1.2.2TT法檢測細(xì)胞增殖抑制率實(shí)驗(yàn)分組同前，各組設(shè)4個(gè)復(fù)孔，分別搜集轉(zhuǎn)染及未轉(zhuǎn)染細(xì)胞，按每孔1104個(gè)細(xì)胞接種于96孔培養(yǎng)板，細(xì)胞貼壁后，根據(jù)分組參加所需試劑及藥物。72h后，每孔參加20l的TT

11、，繼續(xù)培養(yǎng)4h，棄上清，加150l的二甲基亞砜(DS)室溫振蕩10in后570n波長處測定光密度值(D570)。細(xì)胞抑制率(%)=(1-D570處理組/D570對照組)100%。1.2.3免疫細(xì)胞化學(xué)檢測survivin蛋白的表達(dá)棄培養(yǎng)基，PBS沖洗2次，固定，再次PBS沖洗。根據(jù)SP9001試劑盒說明書進(jìn)展操作，二氨基聯(lián)苯胺(DAB)顯色。survivin以細(xì)胞質(zhì)出現(xiàn)棕黃色顆粒為陽性細(xì)胞。1.2.4esternblt法檢測survivin蛋白的表達(dá)搜集各組細(xì)胞，用預(yù)冷的PBS洗滌2遍，參加細(xì)胞裂解液，冰浴30in進(jìn)展充分裂解。4低溫離心機(jī)13000r/in離心5in，取上清，F(xiàn)rlin酚法測

12、蛋白濃度。100g/孔上樣，進(jìn)展12.5%Tris-甘氨酸SDS聚丙烯酰胺凝膠和5%的積層膠電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉。分別參加一抗兔抗人survivin及-atin多克隆抗體，4孵育過夜，堿性磷酸酶標(biāo)記羊抗兔IgG孵育2h，四唑硝基藍(lán)(NBT)/5-溴-4-氯-3-吲哚基-磷酸鹽(BIP)顯色。一抗及二抗?jié)舛染鶠?1000，用圖像分析系統(tǒng)測定各條帶的灰度值，并用IageJ圖像分析軟件分析。以-atin為內(nèi)參，表示survivin蛋白的相對表達(dá)強(qiáng)度。1.2.5Hehst33258檢測細(xì)胞凋亡形態(tài)Hehst33258染色：棄培養(yǎng)基，PBS沖洗2遍，固定，再次PBS沖洗。根據(jù)說明書進(jìn)展染色。熒光顯微鏡下觀察

13、拍照。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理用SPSS13.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)展統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量資料采用s表示，多個(gè)樣本均數(shù)比擬采用方差分析，兩兩比擬用q檢驗(yàn)，相關(guān)性檢驗(yàn)用Pearsn相關(guān)分析。P0.05認(rèn)為差異有顯著性。2結(jié)果2.1熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)轉(zhuǎn)染6h后，出現(xiàn)綠色熒光，細(xì)胞碎片增多。見圖1。2.2轉(zhuǎn)染survivinsiRNA后胃癌細(xì)胞SG7901對順鉑敏感性的影響TT法檢測發(fā)現(xiàn)DDP組、轉(zhuǎn)染組及結(jié)合作用組對SG7901細(xì)胞的增殖有較明顯的抑制作用。其中結(jié)合作用組的細(xì)胞增殖抑制率最高，與其余各組相比差異有顯著性(P0.05)。見表1。圖1綠色熒光蛋白FIT標(biāo)記siRNA轉(zhuǎn)染轉(zhuǎn)貼于論文聯(lián)盟.ll.SG790

14、1細(xì)胞(400)2.3轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞中survivin蛋白表達(dá)程度的改變2.3.1免疫細(xì)胞化學(xué)檢測結(jié)果與ntrl組、lip組、siRNA組和DDP組相比,轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中survivin蛋白表達(dá)明顯降低(P0.05)。見圖2、表2。表1SurvivinsiRNA對SG7901細(xì)胞增殖的抑制作用表2各組SG7901細(xì)胞survivin蛋白的表達(dá)與其余各組比擬：#、*P0.05;與DDP組比擬：P0.052.3.2esternblt法檢測結(jié)果轉(zhuǎn)染組survivin蛋白的表達(dá)明顯低于其余各組(P0.05);DDP組作用細(xì)胞72h后，survivin蛋白的表達(dá)明顯高于其余各組(P0.05)。見表3。2.4轉(zhuǎn)

15、染前后對細(xì)胞凋亡的影響Hnhest33258染色顯示ntrl組、Lip組和siRNA組細(xì)胞的細(xì)胞核完好，呈正常的藍(lán)色;DDP組、轉(zhuǎn)染組及結(jié)合作用組細(xì)胞的細(xì)胞核染色增強(qiáng)、核質(zhì)濃縮、核碎裂，呈凋亡改變。表3各組SG7901細(xì)胞中survivin蛋白的D值與其余各組比擬：#P0.05;與DDP組比擬：*P0.053討論胃癌是常見的消化道惡性腫瘤,世界胃癌發(fā)病率為13.86/10萬,僅次于肺癌居惡性腫瘤的第2位。在我國胃癌的發(fā)病率及死亡率均居惡性腫瘤之首,每年死于胃癌者達(dá)16萬人,占全部惡性腫瘤死亡人數(shù)的23%。由于胃癌早期診斷率較低，而進(jìn)展期胃癌單純根治手術(shù)年生存率僅40%，即使擴(kuò)大切除范圍的超根治

16、術(shù)也未明顯進(jìn)步生存率，因此，目前臨床上化療對于胃癌的治療具有重要意義。順鉑由于其抗腫瘤作用明顯、價(jià)格低廉，并且可應(yīng)用于多種腫瘤的化療，是目前臨床最常用的化療藥物之一，在腫瘤的治療中占有重要地位。但是長期運(yùn)用順鉑會造成機(jī)體對其敏感性降低，從而嚴(yán)重影響了化療效果，并且降低了患者的生存率。survivin直接作用于aspase，主要通過抑制凋亡終末效應(yīng)器aspase-3和aspase-7或干擾aspase-9的活性，阻斷細(xì)胞凋亡的共同通路。而順鉑也是通過aspase-3依賴的信號傳導(dǎo)途徑，誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡而抑制腫瘤細(xì)胞的生長，從而到達(dá)抗腫瘤的效果3。并且有研究顯示，在耐順鉑的人胃癌細(xì)胞中，surv

17、ivin表達(dá)明顯高于普通人的胃癌細(xì)胞4。因此，我們認(rèn)為降低腫瘤細(xì)胞中survivin的表達(dá)可能可以增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞對順鉑的藥物敏感性。本實(shí)驗(yàn)采用RNA干擾(RNAinterferene，RNAi)技術(shù)特異性的降低survivin在SG7901中的表達(dá)。RNAi技術(shù)是利用雙鏈RNA(dsRNA)可以特異性地降解具有同源序列的RNA，特異性地阻斷相應(yīng)基因的表達(dá)，從而成為近年來較為熱門的一種研究基因功能和進(jìn)展基因治療的新方法5。RNAi在胞質(zhì)dsRNA特異性核酸內(nèi)切酶(Dier)的作用下裂解成為具有2123nt堿基的短片段dsRNA分子，稱之為siRNA，siRNA與核酶復(fù)合體結(jié)合形成RNA誘導(dǎo)的沉默復(fù)

18、合物(RIS),RIS通過堿基配對方式與同源靶向RNA結(jié)合后，從siRNA的3端將靶RNA切割成小于12nt的片段并使其降解，從而阻斷相應(yīng)基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后基因沉默機(jī)制6。與傳統(tǒng)的基因治療方法相比，RNAi技術(shù)具有特異、高效和毒性小的特點(diǎn)，有著明顯的優(yōu)勢。本研究采用脂質(zhì)體包裹survivinsiRNA轉(zhuǎn)染SG7901細(xì)胞6h后，熒光顯微鏡下可以看見綠色熒光，出現(xiàn)細(xì)胞碎片，并且轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞survivin蛋白的表達(dá)明顯降低。結(jié)合作用組Hnhest染色可見SG7901細(xì)胞核染色增強(qiáng)、核質(zhì)濃縮、核碎裂，呈凋亡改變的細(xì)胞明顯多于DDP組。而轉(zhuǎn)染后順鉑對SG7901的細(xì)胞增殖抑制率從轉(zhuǎn)染前的(42.972.73)%進(jìn)步到(63.934.22)%。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，通過RNAi技術(shù)特異性地下調(diào)胃癌SG7901細(xì)胞中survivin的表達(dá)，可以明顯增加SG7901對順鉑的敏感性，增強(qiáng)順鉑對細(xì)胞的殺傷作用，從而為臨床治療胃癌提供了一個(gè)新的思路?！緟⒖嘉墨I(xiàn)】1ZaffarniN,DaidneG.Survivinexpressinandresistanetantianertreatent:perspetivesfrnetherapeutiinterventinsJ.Dru