川烏煎煮時間和給藥劑量與毒性的相關(guān)性研究

1、川烏煎煮時間和給藥劑量與毒性的相關(guān)性研究【摘要】目的提醒川烏煎煮時間、給藥劑量與毒性的相關(guān)性。方法采用均勻設(shè)計的方法，將川烏分別煎煮15in，30in，1，2，3，4，6h，生藥含量依次為臨床用量的6，12，24，48，72，96，120倍。模型對照組和各給藥組于復(fù)制痹證動物模型后，按組給藥30d。觀測動物生長發(fā)育、血液學(xué)、血液生化學(xué)、臟器系數(shù)、病理組織學(xué)變化及停藥15d后上述指標(biāo)的變化。將結(jié)果進(jìn)展多元回歸分析，得出川烏煎煮時間、劑量與毒性的相關(guān)性。結(jié)果川烏水煎液能抑制痹證動物的足跖腫脹；對模型動物的生長發(fā)育無明顯影響；對其造血系統(tǒng)無明顯毒性；對其肝臟、腎臟、心臟有一定毒性。川烏水煎液毒性最大

2、的煎煮時間和給藥劑量是30in,120倍。結(jié)論煎煮30in，給藥劑量為臨床用量120倍時，川烏水煎液對痹證動物產(chǎn)生的毒性最大，但藥效最正確?！娟P(guān)鍵詞】川烏煎煮時間給藥劑量毒性均勻設(shè)計Abstrat：bjetiveTstudytherrelatinbeteendetingtie(DT),adinistratindsage(AD)andthetxiityfRadixAniti(RA).ethdsArdingtunifrdesignedtehnlgy,RAasdetedithdifferentduratinf15inutes,30inutes,1hur,2hurs,3hurs,4hursand6hu

3、rs,andthententfRAas6ties,12ties,24ties,48ties,72ties,96ties,120tiesfliniADrespetively.AllratsexeptnralntrlgrupereadeupBiZhenganialdel,andadinisteredRAdetedliquidsfr30days.Thehangesfheatlgy,bldbiheistry,rganeffiient,histpathlgytestindexeredetetedbefreandafter15days.Theregressinanalysisasadptedtstudyt

4、herelativitybeteenDT,ADandthetxiityfRA.ResultsRAdetedliquidsulddereasevixpedistuefatinfBiZhengdelanials,buthadneffetnthegrthanddevelpentandheatpietisystefdelanials.Theyhadertaintxiitytlivers,kidneys,andheartsfthedelanial.TheDTandADfaxialtxiityfRAdetedliquidsere30inutesand120ties.nlusinRAdetedliquids

5、ithDT30inandAD120tieshavetheaxialtxiityandthebestediinaleffet.Keyrds：RadixAniti(RA);Dettingtie(DT);Adinistratindsage(AD);Txiity;UnifrDesign川烏為毛茛科植物烏頭AnituarihaeliDebx.的枯燥母根。始載于?神農(nóng)本草經(jīng)?，列為下品。其味苦、辛，大熱，有大毒，功能祛風(fēng)除濕、溫經(jīng)散寒、行淤止痛1。研究說明川烏具有良好的鎮(zhèn)痛、抗炎和免疫抑制作用，但因其毒性大，臨床上常因用藥不當(dāng)而造成中毒甚至死亡25。目前，川烏的毒理學(xué)實(shí)驗(yàn)研究較少，已報道的川烏長期毒性實(shí)驗(yàn)

6、中，均采用正常安康動物6，對病證模型動物的毒性研究目前未見。煎煮時間與給藥劑量是影響川烏毒性的重要因素。其煎煮時間，臨床報道從15in6h不等，也有以口嘗不麻為度；給藥劑量，臨床應(yīng)用從1.560g不等。因此實(shí)驗(yàn)根據(jù)臨床實(shí)際應(yīng)用和前期完成的急毒實(shí)驗(yàn)情況，設(shè)定了7個煎煮時間點(diǎn)和給藥劑量，并引入均勻設(shè)計法，研究不同煎煮時間，給藥劑量的川烏水煎液對痹證動物模型的長期毒性的影響。1材料與儀器1.1藥物川烏，購自四川江油，經(jīng)成都中醫(yī)藥大學(xué)中藥鑒定教研室鑒定為毛茛科植物烏頭AnituarihaeliDebx.的枯燥母根。參見?中國藥典?2000年版制劑通那么項，以3倍量水浸泡30in，加至10倍量水煎煮，煎

7、煮時間分別取煮沸后15in，30in，1h，2h，3h，4h，6h等7個時間點(diǎn)，煎煮完畢減壓濃縮為每毫升含原生藥1g。根據(jù)均勻設(shè)計表U7(74)，川烏煎煮15in，30in，1h，2h，3h，4h，6h7個時間點(diǎn)分別取臨床劑量3g60kg-1d-1的72倍，12倍，120倍，48倍，6倍，96倍和24倍。實(shí)驗(yàn)時用蒸餾水配制成適當(dāng)濃度的藥液。造模藥物為完全弗氏佐劑美國Siga公司產(chǎn)品。1.2動物SPF大鼠180只，雄性，體重130160g，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供，合格證號：川實(shí)動管質(zhì)SXK(川)202212號。1.3儀器與試劑電子天平；KX21N型電子血球自動計數(shù)儀日本Sysex公

8、司；TS1024i型全自動血液生化分析儀日本東京貿(mào)易株式會社；光學(xué)顯微鏡日本奧林巴斯儀器公司，游標(biāo)卡尺，YT-100電子壓痛儀等。Urea，rea，TP，ALB，ALT，AST，ALP檢測試劑盒上海申能德賽診斷技術(shù)消費(fèi)，消費(fèi)批號依次為：310/021/1，171/014/1，231/021/01，022/018/03，4609/23262/01，4704/23872/02，5406/26835/1；T，TG檢測試劑盒中生北控生物科技股份消費(fèi)，消費(fèi)批號依次為：202206，202202；TBIL，GLU檢測試劑盒四川美辰生物科技消費(fèi)，消費(fèi)批號依次為：0504，0506；TT檢測試劑盒RHE公司消

9、費(fèi)，消費(fèi)批號050186。1.4實(shí)驗(yàn)設(shè)施SPFspeifipathgenfreenditin實(shí)驗(yàn)動物屏障系統(tǒng)，由成都中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動物研究中心提供，使用答應(yīng)號：第05-50號。2方法2.1動物分組與造模及給藥安康合格的SPF大鼠180只，全雄，隨機(jī)分為9組，即空白對照組、模型對照組、生川烏15in水煎液組、30in水煎液組、1h水煎液組、2h水煎液組、3h水煎液組、4h水煎液組和6h水煎液組，每組20只。模型對照組和各給藥組于大鼠右足足跖處注射完全弗氏佐劑0.1l/只。從造模當(dāng)天開場，各組每日于911A按大鼠體重10lkg-1d-1分別灌喂蒸餾水、不同煎煮時間點(diǎn)的生川烏水煎液，共30d。2.2

10、檢測指標(biāo)2.2.1一般狀態(tài)觀察觀察動物造模及給藥期間的一般行為活動和精神狀況，每周記測1次體重；測量大鼠足腫脹度：分別于造模前、造模后0.5h,18h，第2天至第10天上午8時用游標(biāo)卡尺法測定各組大鼠右足腫脹度，第11天至第30天上午8時測定各組大鼠左、右足腫脹度。2.2.2血液學(xué)及血生化學(xué)檢測末次給藥24h后，每組隨機(jī)取12只大鼠，股靜脈采血，作B，RB，Hb，HT，V，H，H，PLT，Ret計數(shù)檢測，以及GLU，UREA，REA，TP，ALB，ALT，AST，TBIL，T，TG以及電解質(zhì)Na，K，l離子的測定。2.2.3系統(tǒng)剖檢與臟器系數(shù)及組織病理學(xué)檢測脫頸椎法處死動物，進(jìn)展系統(tǒng)剖解。稱其

11、臟器濕重并計算臟器系數(shù)。組織病理學(xué)檢測：取動物心、肝、脾、肺、腎、腦、甲狀腺、胸腺、腎上腺、胰腺、脊髓、食管、氣管、胃、小腸、大腸、睪丸、附睪、前列腺組織各一塊，立即投入10%甲醛液內(nèi)固定，石蠟包埋，切片，HE染色，光學(xué)顯微鏡下觀察。痹證關(guān)節(jié)病理組織觀察：取左、右踝關(guān)節(jié)，采用10%中性甲醛溶液固定，24h后用混合脫鈣液加溫脫鈣48h，常規(guī)進(jìn)展石蠟包埋，切片5，HE染色，光鏡下觀察。2.3可逆性觀察剩余動物作一般狀態(tài)觀察，每周記測1次體重。15d后處死，進(jìn)展系統(tǒng)剖檢，稱取臟器濕重，計算臟器系數(shù)，組織病理學(xué)檢查，血液學(xué)及血液生化學(xué)檢測，指標(biāo)和方法同前。2.4統(tǒng)計學(xué)方法數(shù)據(jù)資料先用SPSS統(tǒng)計軟件單

12、因素方差分析進(jìn)展統(tǒng)計學(xué)處理，再用均勻設(shè)計軟件進(jìn)展多元回歸分析。3結(jié)果3.1川烏水煎液給藥30d一般狀態(tài)觀察受試動物用藥期間，一般行為活動正常，對刺激反響靈敏，無呆滯、嗜睡，無躁動、震顫，無流涎、流涕，飲水、攝食正常，糞便質(zhì)地?zé)o異常，會陰部無污穢。各組體重?zé)o明顯差異。3.2川烏水煎液給藥30d大鼠足跖腫脹度各給藥組大鼠右后足致炎側(cè)于造模后18h至第2天，足跖和踝關(guān)節(jié)明顯紅腫，部分皮溫增高，腫脹度到達(dá)峰值，持續(xù)2d后逐漸減輕，第21天左右又出現(xiàn)一次腫脹頂峰。第11天，與空白對照組比擬，給藥組大鼠左足有明顯腫脹。給藥期間，各給藥組大鼠的左、右足腫脹度較模型組有不同程度的減輕P0.05或P0.01或P

13、0.001。藥效發(fā)揮最正確的煎煮時間和給藥劑量集中在30in,120倍。部分足腫脹度測定數(shù)據(jù)見表12。表1川烏水煎液給藥30天對大鼠右足足跖腫脹度的影響略表2川烏水煎液給藥30d大鼠左足足跖腫脹度的影響略表1回歸分析：第5天腫脹度回歸方程：Y0.6113.10103X15.42105X1X21.86105X221.44107X23(最優(yōu)條件：煎煮時間30in，給藥劑量120倍)；第13天腫脹度回歸方程：Y0.6131.74103X11.15105X24.54105X1X28.14X22(最優(yōu)條件：煎煮時間30in，給藥劑量120倍)；第21天腫脹度回歸方程：Y0.6322.94104X1X25

14、.07106X12X22.91X22X1(最優(yōu)條件：煎煮時間30in，給藥劑量120倍)；第26天腫脹度回歸方程：Y0.5621.21102X19.94104X22.87104X121.30104X1X24.90108X23(最優(yōu)條件：煎煮時間30in，給藥劑量120倍)；第30天腫脹度回歸方程：Y0.5961.35103X11.16104X22.96107X1X2(最優(yōu)條件：煎煮時間30in，給藥劑量120倍)。表2回歸分析：第13天左足腫脹度回歸方程：Y0.3861.26103X28.98106X225.18107X22X1最優(yōu)條件：煎煮時間30in，給藥劑量120倍；第17天腫脹度回歸方

15、程：Y0.3668.34104X13.27104X29.03105X2X11.18106X22X11.51108X23最優(yōu)條件：煎煮時間30in，給藥劑量120倍；第27天腫脹度回歸方程：Y0.3251.24103X27.79106X122.28105X221.08107X23最優(yōu)條件：煎煮時間30in，給藥劑量104.2倍。3.3川烏水煎液給藥30d大鼠血液學(xué)、血液生化學(xué)檢測各組大鼠血液學(xué)各項指標(biāo)均在正常范圍內(nèi)。血液生化學(xué)指標(biāo)中，除2h組外的其余各給藥組rea值較空白對照組顯著增高。對異常指標(biāo)進(jìn)展多元回歸分析：rea值回歸方程：Y45.73.45X10.162X28.92102X121.88

16、103X221.09103X12X2。結(jié)果顯示毒性最大的煎煮時間與給藥劑量是30in，120倍。部分血液生化學(xué)檢測數(shù)據(jù)見表3。表3川烏水煎液給藥30d對大鼠血液生化學(xué)的影響略3.4川烏水煎液給藥30d臟器系數(shù)、病理組織學(xué)檢查1h組腎臟臟器系數(shù)明顯高于空白對照組，腎臟器系數(shù)回歸方程Y6.785.1102X11.04102X25.7103X1X27.93105X22X1,結(jié)果顯示毒性最大的煎煮時間與給藥劑量是30in，38.15倍。部分臟器系數(shù)檢測數(shù)據(jù)見表4。表4川烏水煎液給藥30d對大鼠臟器系數(shù)的影響略病理組織學(xué)檢查結(jié)果：15in組有1例心臟局灶性炎癥；30in組有1例肝脂肪樣變；15in組有2

17、例腎臟局灶性炎癥。模型組有7例踝關(guān)節(jié)軟組織充血、水腫。3.5生川烏水煎液停藥可逆性觀察受試動物停藥期間，生長發(fā)育正常，一般行為和一般狀態(tài)正常，各組間體重?zé)o明顯差異。3h組Urea值較空白組有明顯升高，Urea值的回歸方程：Y10.50.536X16.91102X21.3102X123.53104X225.11105X1X22，結(jié)果顯示毒性最大的時間與劑量是30in，120倍。6h組腎臟和15in組腦的臟器系數(shù)較空白組明顯升高。腎臟器系數(shù)回歸方程：Y7.281.44102X121.64103X1X24.59104X13。腦臟器系數(shù)回歸方程：Y5.384.65102X12.21102X21.471

18、03X124.04104X222.08106X23。結(jié)果顯示，毒性最大的煎煮時間與給藥劑量分別是20.55in，6倍和15.85in，120倍。病理組織學(xué)檢查結(jié)果顯示，各給藥組動物的組織器官均為正常，模型組有4例踝關(guān)節(jié)軟組織有慢性炎癥及纖維組織增生。部分血液生化學(xué)指標(biāo)測定數(shù)據(jù)見表5。表5生川烏水煎液停藥15d對大鼠血液生化學(xué)的影響略4討論當(dāng)前，藥物長期毒性實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)動物一般選用安康動物。由于烏頭類有毒中藥的平安性研究中大量實(shí)驗(yàn)已證明，烏頭類中藥水煎液對疾病模型動物產(chǎn)生的毒性效應(yīng)與安康動物有差異楊卓.?附子煎煮時間、給藥劑量與毒性的相關(guān)性研究?.成都中醫(yī)藥大學(xué)2002級碩士學(xué)位論文。結(jié)合病證動物模型研究川烏的毒性將對臨床用藥更具指導(dǎo)意義，因此我們選用佐劑性關(guān)節(jié)炎模型大鼠作為研究川烏長期毒性的實(shí)驗(yàn)對象，提醒生川烏水煎液煎煮時間和給藥劑量與毒性的相關(guān)性。由于影響中藥毒性的因素多元化，故本課題引入了數(shù)學(xué)的方法均勻設(shè)計。其特點(diǎn)為每因素的每程度只作一次實(shí)驗(yàn)，實(shí)驗(yàn)次數(shù)等于程度數(shù)。應(yīng)用均勻設(shè)計法得