土壤棉花黃萎病菌分離方法

1、土壤棉花黃萎病分離方法方案一、土壤稀釋分離法供試藥劑：牛膽鹽、鏈霉素、1%六偏磷酸鈉、供試儀器：一、培養(yǎng)基制備馬鈴薯200g，瓊脂17g，葡萄糖g，蒸餾水1000ml，高壓滅菌冷卻至45C時(shí)，按每100ml 培養(yǎng)基分別加入牛膽鹽和鏈霉素各50mg。二、土樣選擇選取棉花耕作層020cm層內(nèi)土樣（此區(qū)域內(nèi)微菌核數(shù)量與田間病害發(fā)病有密切聯(lián)系）。三、分離方法1、洗滌微菌核 取自然風(fēng)干過篩的病田土樣100mg，置盛200ml含有1%六偏磷酸鈉無菌 水的三角瓶內(nèi)，搖動(dòng)10min后，靜止5min，棄去清液，留殘?jiān)?0ml于瓶底，連續(xù)洗滌5 次。將最后一次的20ml殘?jiān)褐糜谂囵B(yǎng)基上，每皿1ml，均勻涂抹于

2、表面，24C左右培養(yǎng) 1015d。2、觀察微菌核 肉眼從培養(yǎng)皿背面看到菌落時(shí)，用蠟筆做出標(biāo)記，再用低倍顯微鏡觀察鑒 定，將顯微鏡下確認(rèn)的棉花黃萎病菌微菌核移出純化。（棉田土壤黃萎病菌微菌核的研究，呂金殿，楊家榮，吉冉中）1990方案二真菌、細(xì)菌、放線菌、霉菌土壤稀釋分離法供試藥劑：供試儀器：玻璃珠。1 .取土壤取表層以下510cm處的土樣.放入滅菌的袋中備用，或放在4。冰箱中暫存。制備稀釋液，土壤稀釋法，（要無菌操作）（1）制備土壤懸液：稱土樣0.5g，迅速倒入帶玻璃珠的無菌水瓶中（玻璃珠用量以充滿瓶底 為最好），振蕩510min使土樣充分打散，即成為10-2的土壤懸液。（2）稀釋：用無菌移液

3、管吸10-2的土壤懸液0. 5mL.放入4. 5mL無菌水中即為10-3稀 釋液，如此重復(fù)，可依次制成10-3 10-8的稀釋液（真菌10-310-1）。注意：操作時(shí)管尖不能接觸液面，每一個(gè)稀釋度換用1支移液管，每次吸入土液后，要將 移液管插入液面，吹吸3次，每次吸上的液面要高于一次，以減少稀釋中的誤差。（微生物實(shí)驗(yàn)指導(dǎo)）方案三、水篩法分離及微菌核計(jì)數(shù)方法供試藥劑：NaNO，MgSO 7H、O，K HPO，F(xiàn)e,（SO.）,7HO，KCl，氯霉素，井岡霉34224243 2素，五氯硝基苯，克菌丹，1%多聚磷酸鈉，0.01%TergitoNPX供試儀器： 組織攪拌器（8000r/min），0.1

4、25mm 篩網(wǎng)，0.0385mm篩網(wǎng)。一、制備培養(yǎng)基棉選一號(hào)NaNO 2g, MgSO 7HO0.5g,KHPO 1g, Fe (SOI 7HO0.01g,KCl 0.5g,3DD42242、432dd蔗糖5g,瓊脂15g，蒸餾水1000ml，氯霉素300mg，井岡霉素2.5ppm (mg/kg),五氯硝基苯 350ppm （mg/kg）,克菌丹 0.5ppm （mg/kg）。滅菌后添加。注意：1、五氯硝基苯：有毒，不可直接接觸。熔點(diǎn)：144C沸點(diǎn)：328C，相對(duì)密度（水=1） 1.72,可燃， 不溶于水，微溶于醇、苯、氯仿、二硫化碳。在高溫干燥的條件下會(huì)爆炸分解，對(duì)環(huán)境有嚴(yán)重危害，應(yīng)特 別注

5、意對(duì)水體的污染。2、克菌丹：有毒，不可直接接觸。熔點(diǎn)：178C，沸點(diǎn)：314.2C,在中性或酸性條件下穩(wěn)定，在高溫 和堿性條件下易水解。二、水篩法分離1、采用5點(diǎn)取樣法，從棉花耕作層020cm深處采取病土，每點(diǎn)100g, 5點(diǎn)共采集500g病 土，置室內(nèi)自然風(fēng)干5d左右。2、將風(fēng)干土樣倒入消毒搪瓷杯內(nèi)并加入10枚11.2cm大小的潔凈鵝卵石，振蕩15min，使 土樣粉碎。3、稱取上述土樣2.5g,共6份，每份土樣分別放入200ml內(nèi)含1%多聚磷酸鈉及0.01%TergitoNPX （表面活性劑一）的水溶液內(nèi)，依次倒入組織攪拌器內(nèi)，以8000r/min 攪拌15s。4、將此土壤懸浮液倒入上層孔徑

6、為0.125mm,下層孔徑為0.0385mm的雙層細(xì)篩里，在水 流下降泥土沖洗干凈，用吸管吸取10ml無菌水，將下層洗好后的殘?jiān)鼪_洗到消毒的培養(yǎng)皿 內(nèi)備用。5、將洗好的6分土壤殘?jiān)?，每份均勻涂抹?個(gè)盛有供試培養(yǎng)基（棉選一號(hào)）平皿的表 面，并將平皿置2425C恒溫箱內(nèi)培養(yǎng)14d后取出，用自來水洗去平皿表面泥土，再用肉眼 或低倍顯微鏡經(jīng)行檢查。6、計(jì)數(shù)方法：平板上每個(gè)黃萎病菌落假設(shè)來源于一個(gè)單個(gè)微菌核，計(jì)算5個(gè)平板上的菌落 總數(shù)，即等于2.5g 土樣中的微菌核數(shù)。三、回接試驗(yàn)：1、將棉選一號(hào)培養(yǎng)基上分離到的黃萎病菌菌落，用PDA培養(yǎng)基純化培養(yǎng)10天。2、待回接試驗(yàn)所用的紙缽內(nèi)棉苗長到1一2片真

7、葉時(shí)，將純化后的菌種，用無菌水配翹成每 耐含3*107個(gè)泡子懸浮液。3、每紙缽量取10 m l上述懸浮液，用紙缽蘸根法進(jìn)行回接，共接菌10個(gè)紙缽，每紙缽5 6 個(gè)棉苗，以清水蘸根作對(duì)照。4、病菌后的棉苗放入25C的光照培養(yǎng)箱內(nèi)，25天后調(diào)查發(fā)病情況，并將病株用PDA培養(yǎng)基 進(jìn)行再分離。（棉黃萎病菌選擇性培養(yǎng)基一一棉選一號(hào)，籍秀琴，未穎初）1988方案四、水篩法分離及微菌核計(jì)數(shù)方法供試藥劑：棉籽餅、金霉素、五氯硝基苯;PCNG）、1 %六偏磷酸鈉（Calgon）、0.5%NaOCl。 供試儀器：129目（0.113mm）篩網(wǎng)、400目（0.038mm）篩網(wǎng)。1、棉籽培養(yǎng)基（培養(yǎng)基是由8種選擇性培

8、養(yǎng)基的比較后改良而來的）棉籽餅粉10g,蒸餾水500ml，煮沸1520min，過濾，取濾液并補(bǔ)蒸餾水至1000ml，加入瓊脂10g,高壓滅菌（121C, 30min）,冷卻至50C后加PCNB（五氯硝基苯）1g,金霉素5mg。2、水篩法：稱取10g風(fēng)干一周以上的供試土樣，懸浮在2 0 m l含有1 % Calgon（六偏 磷酸鈉）和0.01 % Tergitol一 N P X溶液中，用組織攪拌機(jī)（800 一 1,000 r/min ）攪拌30秒， 讓土粒充分分散。3、過重疊的129目和400目篩子，將截留物放到0.5% NaOCl溶液中漂洗兩次進(jìn)行表 面滅菌，每次10秒，再用冷開水沖洗殘留的N

9、aOCl，最后用水把截留物洗入大試管或小燒 杯中。4、用10 m】大口吸管或湯匙把篩濾物均勻分布在10個(gè)盛有培養(yǎng)基的培養(yǎng)皿內(nèi)，培養(yǎng)皿 正放于,25 28C下培養(yǎng)10天左右。培養(yǎng)后置培養(yǎng)皿于解剖鏡下或低倍顯微鏡下檢查有無黑 色的微菌核。5、10個(gè)平板為一組所形成的微菌核總數(shù)就等于10g 土壤中的微菌核的數(shù)量。計(jì)算公式是N2為每克土中微菌核數(shù)；N為10個(gè)平板中每皿各數(shù)30個(gè)視野的微菌核平均數(shù)；R1為視 野的半徑；r2為培養(yǎng)皿的半徑。（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)1987年第01期，土壤中棉花黃萎病菌微菌核的分離和計(jì)數(shù)方法，林 先貴）1987方案五、水篩法分離供試藥劑： l%多聚磷酸鈉、0.015%Tergito、0.13 %氯霉素、0.08 %紅霉素。供試儀器：DS200型組織搗碎機(jī)、100目篩網(wǎng)，400目篩網(wǎng)。1、稱取0 .75g供測(cè)土樣，置于l%多聚磷酸鈉和0.015%Tergito的水溶液中，充分?jǐn)嚢?0秒鐘 （DS200型組織搗碎機(jī)）；2、水篩法：再經(jīng)上層100目，下層400目篩網(wǎng)