高通量測序技術(shù)

1、高通量測序技術(shù)(High-throughput sequencing )又稱“下一代”測序技 術(shù)(Next-generation sequencing technology ),以能次并行對幾十萬至U 幾百萬條DNA分子進行序列測定和一般讀長較短等為標志。根據(jù)發(fā)展歷史、影響力、測序原理和技術(shù)不同等，主要有以下幾種：大規(guī)模平行簽名測序(Massively Parallel Signature Sequencing, MPSS) 、聚合酶克隆(Polony Sequencing ) 、 454 焦磷酸測序(454 pyrosequencing ) 、 Illumina (Solexa) seque

2、ncing 、ABI SOLiD sequencing 、離子半導體測序(Ion semiconductor sequencing ) 、DNA 納米球測序(DNA nanoball sequencing )等。高通量測序技術(shù)是對傳統(tǒng)測序一次革命性的改變，一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定，因此在有些文獻中稱其為下一代 測序技術(shù)(next generation sequencing)足見其劃時代的改變，同時高通量測序使得對一個物種的轉(zhuǎn)錄組和基因組進行細致全貌的分析成為可能，所以又被稱為深度測序(deep sequencing)。實驗過程.樣本準備(sample fragmentati

3、on).文庫構(gòu)建(library preparation).測序反應(yīng)(sequencing reaction).數(shù)據(jù)分析(data analysis) 測序平臺自從2005年454 Life Sciences 公司(2007年該公司被 Roche正式收購)推 出了 454 FLX 焦磷酸測序平臺 (454 FLX pyrosequencing platform) 以來，因為他們的拳頭產(chǎn)品毛細管陣列電泳測序儀系列(series capillary arrayelectrophoresis sequencing machines) 遇至U 了兩個強有力的競爭對手，曾推出過 3730 xl DNA

4、測序儀(3730 xl DNA Analyzer)的 Applied BioSystem(ABI)這家一直占據(jù)著測序市場最大份額的公司的領(lǐng)先地位就開始動搖了， 一個就是羅氏公司(Roche)的454測序儀(Roch GS FLX sequencer),另一個就是2006年美國Illumina 公司推出的Solexa基 因組分析平臺(Genome Analyzer platform) , 為此，2007年ABI公司推 出了自主研發(fā)的 SOLiD測序儀(ABI SOLiD sequencer)。 這三個測序平臺即 為目前高通量測序平臺的代表。(見表一)公司忠林桂東原理技術(shù)開發(fā)青ApplyBiosy

5、slums AB I)!fc 丁磁珠的犬城校并仃克陵違按DMA蚓丁斌美國AgnwUH匕人址間？熱詞(APG)lllumna臺成淵中法始 UI SNexa 公司者席 J If i- DavidFlocfieXW ?；仓岛獪y序法XJ4S4Lile Sciewes 公司的創(chuàng)始人 JonathanRofhbergHeiioosCompleteGenomes大版模并行單分子合成測產(chǎn)法ONA納第陣列、的合探針楮定連接 的序法美國斯出相上學斗:現(xiàn)工程學宓Stephen Quake1 Complete Genomics 欠。|燈 工狂；4 radoje drmarac表一:主流測序平臺一覽Roche 45

6、4 焦磷酸測序(pyrophosphate sequencing)Illumina Solexa合成測序(sequence by synthesize)Illumina Genome AnalyzerIIx 測序原理Illumina 公司的新一代測序儀 Hiseq 2000和 Hiseq 2500具有高準確性，高通量，高靈敏度，和低運行成本等突出優(yōu)勢，可以同時完成傳統(tǒng)基因組學研究(測序和注釋)以及功能基因組學(基因表達及調(diào)控，基因功能，蛋白/核酸相互作用)研究。Hiseq是一種基于單分子簇的邊合成邊測序技術(shù)，基于專有的可逆終止化學反應(yīng)原理測序時將基因組 DNA的隨機片段附著到光學透明的玻璃表面

7、(即Flow cell),這些DNA片段經(jīng)過延伸和橋式擴增后，在Flow cell上形成了數(shù)以億計 Cluster ,每個Cluster是具有數(shù)千份相同模板 的單分子簇。然后利用帶熒光基團的四種特殊脫氧核糖核甘酸，通過可逆性終止的SBS(邊合成邊測序)技術(shù)對待測的模板DNA進行測序。ABI SOLiD 連接法測序(sequence by ligation)技術(shù)應(yīng)用測序技術(shù)推進科學研究的發(fā)展。隨著第二代測序技術(shù)的迅猛發(fā)展，科學界也開始越來越多地應(yīng)用第二代測序技術(shù)來解決生物學問題。比如在基因組水平上對還沒有參考序列的物種進行從頭測序(de novo sequencing),獲得該物種的 參考序列，

8、為后續(xù)研究和分子育種奠定基礎(chǔ)；對有參考序列的物種，進行全基因組重測序(resequencing),在全基因組水平上掃描并檢測突變位點， 發(fā)現(xiàn)個體差異的分子基礎(chǔ)。在轉(zhuǎn)錄組水平上進行全轉(zhuǎn)錄組測序(wholetranscriptomeresequencing) ,從而開展可變剪接、編碼序列單核甘酸多態(tài) 性(cSNP)等研究；或者進行小分子 RNA 測序(small RNA sequencing) ,通 過分離特定大小的 RNA分子進行測序，從而發(fā)現(xiàn)新的microRNA 分子。在 轉(zhuǎn)錄組水平上，與染色質(zhì)免疫共沉淀(ChIP)和甲基化DNA免疫共沉淀(MeDIP)技術(shù)相結(jié)合，從而檢測出與特定轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合

9、的DNA區(qū)域和基因組上的甲基化位點。這邊需要特別指出的是第二代測序結(jié)合微陣列技術(shù)而衍生出來的應(yīng)用-目標序列捕獲測序技術(shù)(Targeted Resequencing)。這項技術(shù)首 先利用微陣列技術(shù)合成大量寡核甘酸探針，這些寡核甘酸探針能夠與基因組上的特定區(qū)域互補結(jié)合， 從而富集到特定區(qū)段，然后用第二代測序技術(shù)對這些區(qū)段進行測序。目前提供序列捕獲的廠家有 Agilent和Nimblegen , 應(yīng)用最多的是人全外顯子組捕獲測序?？茖W家們目前認為外顯子組測序比全基因組重測序更有優(yōu)勢，不僅僅是費用較低， 更是因為外顯子組測序的數(shù)據(jù)分析計算量較小，與生物學表型結(jié)合更為直接。目前，高通量測序開始廣泛應(yīng)用于

10、尋找疾病的候選基因上。內(nèi)梅亨大學的研究人員使用這種方法鑒定出 Schinzel-Giedion 綜合征中的致病突變，Schinzel- Giedion綜合征是一種導致嚴重的智力缺陷、月中瘤高發(fā)以及多種先天性畸形的罕見病。他們使用 Agilent SureSelect序列捕獲和SOLiD對四位患者的外顯子組進行測序，平均覆蓋度為43倍，讀長為50 nt ,每個個體產(chǎn)生了2.7-3 GB可作圖的序列數(shù)據(jù)。他們聚焦于全部四位患者都攜帶變異體的1 2個基因，最終將候選基因縮小至1個。而貝勒醫(yī)學院基因組測序中心也計劃 對1 5種以Science雜志年度十大科學突破上疾病進行研究，包括腦癌、肝癌、胰腺癌、結(jié)腸癌、卵巢癌、膀胱癌、心臟病、糖尿病、自閉癥以及其 他遺傳疾病，以更好地理解致病突變以及突變對疾病的影響。前不久剛剛結(jié)束的評選中，外顯子組測序名列其中。以上我們盤點了 201 0年第二代測序技術(shù)的最新進展和相關(guān)應(yīng)用。但是除了第二代測序之外，還有另外一種以單分子實時測序和納米孔為標志的第三代測序技 術(shù)也正在如火如荼的發(fā)展中，只是還沒有正式發(fā)布。所以目前科學界所說的高通量測序還指的是第二代測序。意義 高通量測序技術(shù)的誕生可以說是基因組學研究領(lǐng)域一個具有里程碑意義的事件該技術(shù)使得核酸測序的單堿基成本與第一代測序技術(shù)相比急劇下