菌種的誘導(dǎo)培養(yǎng)及蛋白的提取

1、Word文檔 菌種的誘導(dǎo)培養(yǎng)及蛋白的提取 試驗概要：本試驗通過搖瓶培育和發(fā)酵罐培育分別小量和大量誘導(dǎo)菌種表達(dá)，獲得了目的蛋白的粗提物，通過Amylose親和層析獲得純化蛋白。 主要試劑：LB培育基，2-YT培育基，誘導(dǎo)劑IPTG，5N氫氧化鈉，2N鹽酸，葡萄糖主要設(shè)備：恒溫振蕩器，離心機，發(fā)酵罐試驗材料：重組菌試驗步驟1. 搖瓶培育 1) 取出4下平板保藏的菌種，挑取單菌落，接種于5ml LB培育基(含有Amp100ug/ml)的試管中，37,300r/min,恒溫振蕩培育,過夜活化; 2) 然后按5%的接種量將活化菌種接入到含100m1 2-YT培育基(含有Amp 100ug/ml)的500

2、mI搖瓶中，37, 300 r/min,恒溫振蕩培育，作為2L搖瓶培育的菌種。 3) 然后按5%的接種量將活化菌種接入到含400m1 2-YT培育基(含有Amp 100ug/ml)的2L的搖瓶中，37, 300 r/min,恒溫振蕩培育。 起始誘導(dǎo)時機為菌體OD600=4，誘導(dǎo)劑IPTG (IPTG貯液:濃度為20%, 0.22um膜過濾除菌，分裝后-20凍存。)濃度為0.03 mmol/L，誘導(dǎo)表達(dá)的時間掌握在4h左右。2. 5L發(fā)酵罐培育 1) 取出4下平板保藏的菌種，挑取單菌落，接種于5ml LB培育基(含有Amp100ug/ml)的試管中，37, 300 r/min,恒溫振蕩培育。過夜

3、活化; 2) 然后按5%的接種量將活化菌種接入到含100ml 2-YT培育基(含有Amp 100ug/ml)的500mI搖瓶中，37, 300r/min,恒溫振蕩培育，作為5L發(fā)酵罐的菌種。 在基因工程菌株5L高密度發(fā)酵過程中，溫度由系統(tǒng)自動掌握在37，通過自動流加5N氫氧化鈉和2N的鹽酸使pH保持在7左右，葡萄糖的流加采納恒速流加，即培育5h后開時流加補料，以0.042g. (L. min)-1葡萄糖的的速率進行補料。發(fā)酵的IPTG誘導(dǎo)時機均為OD600約為3時進行誘導(dǎo)，IPTG的濃度為0.1 mg/ml。3. 目的蛋白粗提物的獲得1) 試劑配制 CB(Column Buffer)緩沖液:

4、Tris-HCl 20mmol/L(pH 7.4) NaCI 200mmol/L ED TA 1 mmol/L PH 7.4 稱11.7g NaCI, 0.37g EDTA,取20ml Tris-HCl，用NaOH調(diào)至PH7.4，加超純水至1L，用0.22um濾膜濾菌。 2) 提取方法 發(fā)酵液以8 000r/min離心30min收集菌體。菌體收集后用無菌水洗二遍，以洗去表面殘留的培育基。按1:10的比例(W/V)把菌體懸浮在CB溶液中，超聲波破裂細(xì)胞，功率40W，每破裂l0s后間隔2s，每5min取樣，用Bradford法測定可溶性蛋白總量，確定最佳破裂時間。破裂過程中保持低溫(0)，完全破裂

5、后于4以10 000 r/min離心30min，上清液用于上柱純化。4. Amylose親和層析 1) 試劑配制 a. CB(Column Buffer)緩沖液同上 b. CB加麥芽糖(10mmol/L ):稱取3.6g麥芽糖，用CB配成1L溶液，用0.22um濾膜濾菌; c. 0.1%SDS:稱1g SDS，加超純水至1L，用0.22um濾膜濾菌。 2) 層析步驟 a.柱子的清洗:先用20%酒精潤洗柱子2次，裝柱; b.柱子的平衡:新柱料用5倍體積的CB洗柱，再生柱料用3倍體積的CB平衡，流速為2m1/min; c. 上樣:流速為0.5ml/min; d. 洗雜:用CB洗柱至流出液的A值與空白(即CB)相同，流速為2ml/min; e. 洗脫:用CB加麥芽糖洗脫，流速為0.5ml/min，分步收集產(chǎn)品進行SDS分析，確定最佳洗脫條件;將接下的樣品取一小樣，留做檢； f. 柱料的再生:依次用3倍柱體積的無菌水、3倍柱體積的0.lmmol/L SDS溶液、1倍柱體積的無菌水洗柱，