分子生物學常用熒光核酸染料

1、由于只需簡單溫和的物理方法（光照）激發(fā)和檢測，熒光染料是研究生物學微觀世界特別是核酸時最常用的示蹤工具之一。這里的熒光核酸染料主要指能特異結(jié)合核酸并改變發(fā)光特性的化合物，DNA電泳后檢測凝膠的EB大概是最為人熟知的熒光核酸染料吧。除了染膠，熒光核酸染料還可用于熒光原位雜交中作為常見的復染劑，它們能以非共價鍵的方式與DNA/RNA結(jié)合從而顯示原位雜交中的細胞背景信息。根據(jù)它們能否穿透細胞膜進入活細胞體內(nèi)，還可分為兩大類：通透性核酸染料和非通透性核酸染料。生物通在此簡單比較一下在分子生物學實驗和細胞學實驗中常用的熒光染料。分子生物學常用熒光核酸染料熒光核酸染料在分子生物學最常見的應(yīng)用無疑是電泳凝膠

2、染色，以及定量PCR。EBEB（溴化乙錠）本身在紫外下不發(fā)光，能與單鏈、雙鏈甚至三鏈DNA高效結(jié)合并發(fā)出明亮的橙色熒光。因其廉價且靈敏度高，一直是瓊脂糖核酸電泳最常用的熒光染料。EB的使用非常簡單方便，電泳結(jié)束后染色可獲得最佳效果，也可以在制膠時加入進行前染。前染有利于節(jié)約時間，但是易出現(xiàn)條帶變形拖尾等問題。EB-DNA結(jié)合物會導致染料的光漂白和DNA單鏈斷裂，且具有潛在的誘變作用。雖說以前的實驗室里總會有個別做起實驗來“精神可嘉，行為可怕”的家伙，一時找不到手套他們敢徒手拿EB膠，但大多數(shù)人對EB還是“敬而遠之”的，沒事誰都不愿靠近實驗室里跑膠、看膠那一塊地方。偏偏對于搞分子生物學的人來說，

3、跑膠就像吃飯一樣平常，于是大家只能硬著頭皮天天和EB打交道，盼望EB的替代品早點出現(xiàn)在實驗室。生物通在此簡單回顧一下這幾年紛紛登場的EB替代品。SYBR系列染料說到EB的替代物，首先想到的是Invitrogen旗下MolecularProbes專利持有的SYBR系列。自1993年SYBR核酸染料推出以來，就因其靈敏度和易用性而迅速大受歡迎，成為明星產(chǎn)品之。這一系列包括4種染料：SYBRSafe、SYBRGold、SYBRGreenI和SYBRGreenII。赫赫有名的SYBRGreenI熒光染料是最早上市的EB替代品，這種致畸性低而相對安全得多的新染料在標準300nm的紫外透射光下，能檢測低至

4、60pg的dsDNA,比EB至少高了一個數(shù)量級。同時,SYBRGreenI染料-DNA復合物的熒光量子產(chǎn)率約為0.8,相當于EB的5倍。SYBRGreenI的使用和EB同樣簡單，而具有比EB更高的靈敏度，致變性也低得多（有個別宣傳稱之為幾乎無毒），使之迅速成為替代EB的好選擇如果不是貴得多的話就更好了。色如其名，結(jié)合DNA后會發(fā)出美麗的綠色熒光，在拍照時需要配套的濾光片。SYBRGreenI亦即是定量PCR熒光染料法中廣泛使用的熒光染料。為什么選擇它，而不是靈敏度更高的SYBRGold呢？那是因為SYBRGreenI具有雙鏈DNA的專一選擇性。SYBRGreenII與SYBRGreenI則剛好

5、相反，它是檢測RNA或單鏈DNA的高靈敏染料。盡管它不是RNA特異的，但SYBRGreenII與RNA結(jié)合的熒光量子產(chǎn)率（0.54）高于DNA（0.36）。這個性質(zhì)很特別，因為大部分染料都是與雙鏈DNA結(jié)合時量子產(chǎn)率和熒光強度更高。與SYBRGreenI相似，SYBRGreenII也是在254nm透射光下靈敏度最高。如果在300nm透射光下,RNA檢測的金牌恐怕還要頒給SYBRGold。此外，SYBRGreenII染料-RNA復合物的熒光不會被尿素或甲醛淬滅，因此在染色之前不必將變性劑洗脫。SYBRGreenII可檢測凝膠中低至100pg的ssDNA或者2ngRNA條帶，特別適合SSCP分析和

6、RNA分析。SYBRGold是這一系列中靈敏度最高的。它一旦結(jié)合核酸，熒光會增強1000倍以上，量子產(chǎn)率約為0.6。而EB僅為30倍，量子產(chǎn)量大約在0.15。因此，利用300nm紫外透射儀和黑白成像，SYBRGold檢測凝膠中DNA和RNA的靈敏度比EB高10倍以上。色如其名，可以觀察到金色的條帶。SYBRGold染料可用于檢測包括雙鏈DNA，單鏈DNA和RNA，適用于瓊脂糖凝膠電泳、變性梯度凝膠電泳（DGGE）、單鏈構(gòu)象多態(tài)性（SSCP）研究，以及其他常規(guī)的分析。SYBRSafe既然名為safe，自然是安全第一。它的誘變性比EB要低得多，但檢測靈敏度與EB相當。使用方法也相同，既可以在制膠的

7、時候加入，也可以在電泳后進行染色。SYBRSafe的激發(fā)峰在280和502nm,發(fā)射峰在530nm。因此，核酸被染色后，可通過標準的紫外透射儀、可見光透射儀或激光掃描儀來查看。大家都知道，紫外光對DNA片段是有損傷的，Invitrogen曾做過實驗，讓1.25kb的基因片段在紫外光下暴露2分鐘，再切膠回收、連接、轉(zhuǎn)化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)平板上的克隆數(shù)幾乎為零。如果你用SYBRSafe搭配藍光透射儀，就不會有這種問題，也無需擔心紫外線對眼睛的損傷。生物通小貼士：SYBR染料雖是EB的替代，但用法和EB不盡相同，染色時也有一些需要特別注意的地方。首先是pH值。Invitrogen的專家發(fā)現(xiàn)pH是影響染色效率

8、的重要因素。如果它高于8.3或低于7.5,你會發(fā)現(xiàn)靈敏度顯著下降。另外一點也很容易忽視,Tris緩沖液的pH值在49會比室溫下明顯升高。如果在室溫時你的緩沖液配制成pH8.0,那么在4CpH將會升高到8.5.因此如果你要冷藏染色液，那么它在室溫下的pH值應(yīng)是7.5。其次，很多研究人員習慣于制備含有溴化乙錠染料的凝膠。SYBRGreen染料也能如此使用，不過核酸的遷移率會受到影響，靈敏度也會稍有下降，因為背景熒光增加。在預制膠時，染料應(yīng)該在臨灌膠之前，液體足夠冷卻時加入熔化的凝膠中。沸騰和接近沸騰的溫度會破壞SYBRGreen染料染核酸的能力。注意：不要在微波爐中加熱SYBRGreen染料。Lo

9、nza公司也有一種久負盛名的類似SYBRGold的GelStar核酸熒光染料，可高靈敏的檢測凝膠中低至20pg的dsDNA或者3ng的RNA，使用起來和EB一樣可以前染或者后染且無需脫色，可讓你更清晰地觀察實驗結(jié)果。UltraPower核酸染料百泰克公司最近也推出了一種取代EB的無毒花菁染料-UltraPower核酸染料。利用紫外凝膠透射儀來觀測，它的靈敏度比EB染色法高5-10倍，如果配合百泰克UltraPower可見光透射儀，則比EB染色法高8-20倍。樣品熒光信號強，無背景信號。操作也很簡單，可以采用膠染法（同EB）、點染法、泡染法等染色方法，無須脫色或沖洗。瓊脂糖凝膠電泳和PAGE電泳

10、均可使用，價錢當然比進口試劑要便宜很多。目前，百泰克還提供試用裝，歡迎大家申請。GelRed&GelGreen由中國留學生創(chuàng)立的美國Biotium公司提供的GelRed和GelGreen也是EB替代品。根據(jù)獨立的測試服務(wù)公司的標準艾姆斯氏測試結(jié)果，在18.5pg/mL（該濃度遠高于推薦用于電泳后染色的約4pg/mL的3X染色液）濃度下，GelGreen沒有誘變性，而GelRed也僅在S9代謝活化時有微弱的誘變性。GelRed和GelGreen的特殊化學結(jié)構(gòu)使其難以穿透細胞膜進入細胞，正是這一特性降低了染料的細胞毒性。如果您使用的是紫外成像儀，可選擇GelRed；如果您使用激光成像儀或希望在可見

11、光下觀測，可選擇GelGreen。插曲：爭議網(wǎng)絡(luò)上關(guān)于EB替代品安全性的問題一直爭論不休，雖然各品牌都有五花八門的證據(jù)，但EB替代品究竟安不安全？雖然EB為活細胞排斥，但還有具有一定的細胞膜通透性，EB的致變性通常被認為來自于能穩(wěn)定地插入到核酸中而導致核酸復制過程出錯。每種熒光核酸染料都因其能穩(wěn)定插入核酸內(nèi)部從而改變熒光特性才得以成為可用的熒光染料，從理論上都是不安全的，新出的EB替代物的安全性恐怕還需要更長時間來驗證。其實長期在實驗室里工作真可謂“冒著生命危險”的，常常需要與EB啊，同位素啊，細菌病毒啊等各種致癌致畸的試劑打交道。2007年生物通曾經(jīng)聯(lián)手賽默飛世爾公司發(fā)起過實驗室安全調(diào)查，正

12、是有感于短期內(nèi)多次聽到同領(lǐng)域多位人士患可怕重癥的消息，調(diào)查結(jié)果也確實觸目驚心。因此，無論用什么，請大家還是牢記珍愛生命，請帶手套。一時半會兒看不出問題，可年輕的你們，來日方長呢實驗室安全的問題，我們一直不夠重視，但有關(guān)自己的健康，你還能忽視嗎？還有各種染料染色后繼的廢棄試劑，請盡可能的規(guī)范處理，請做個負責任的實驗人通常的處理是活性炭吸附后焚化，就算沒有條件也盡可能處理一下（比如強堿處理，多數(shù)熒光染料會變性）再廢棄，我們的環(huán)境污染實在不需要我們雪上加霜了。言歸正傳，熒光染料在分子生物學中另一個廣泛應(yīng)用就是定量PCR。關(guān)于熒光探針和熒光引物的選擇及優(yōu)缺點比較，那又是一門大學問，詳情請看定量PCR選

13、擇之：熒光探針和熒光引物。細胞生物學常用熒光染料固定細胞的染色PIPI（碘化丙錠）與EB結(jié)構(gòu)相似，PI在水中的溶解度更高，而膜通透性比EB低，不過兩種染料都會被活細胞排斥。PI則常用于檢測死亡或即將死亡的細胞數(shù)量，或了解細胞內(nèi)染色體局部狀況、DNA結(jié)構(gòu)和膜完整性。PI作為紅色熒光復染劑的首選，可與綠色熒光探針或二抗共同使用。DAPI熒光染料DAPI大家應(yīng)該也不陌生。它的學名為4,6-二脒基-2-苯基吲哚，與DNA結(jié)合后發(fā)出藍色熒光，與其他結(jié)構(gòu)的綠色、黃色和紅色熒光形成鮮明的對比。與Hoechst相似，DAPI也是與雙鏈DNA的小溝結(jié)合，特別是AT簇。當它與雙鏈DNA結(jié)合時，熒光強度增強20倍，

14、而與單鏈DNA結(jié)合無熒光的增強。它的熒光強度比Hoechst低，但光穩(wěn)定性高于Hoechst。不過，DAPI在結(jié)合去污劑、磷酸鹽及其他多聚陰離子之后，熒光并不會顯著增強。DAPI是一種極佳的核酸復染劑，能顯示出染色體的清晰帶型。DAPI易溶于水，在PBS中溶解度有限。SYTOX系列染料Invitrogen的SYTOX系列染料也很受歡迎，它們是非通透性的花菁染料，尤其適合于死細胞的染色。使用起來也比較簡單，只需要加到細胞，然后觀察即可，不需要額外的洗滌，因為它們在水溶液中沒有熒光。SYTOX染料適用于多個平臺，包括熒光顯微鏡、流式細胞儀和酶標儀。整個系列目前有紅、橙、黃、綠四種顏色。SYTOX綠

15、色染料與核酸的親和力是整個系列中最高的。一旦與核酸結(jié)合，熒光會增強500倍以上。哇，立馬把PI比了下去。且它的堿基選擇性最小，不像DAPI和PI那么挑剔，只認AT。SYTOX綠色染料可由常用的488nm激光或其他的450-490nm光源激發(fā)。它能輕松地透過質(zhì)膜受損的細胞，但不能穿過活細胞膜。它還特別適合于革蘭氏陽性菌、陰性菌及某些病毒粒子的染色，因為它很亮。SYTOX綠色染料能與紅色、藍色染料一起，進行多色分析。它還能與SYTO17紅色染料進行死細胞和活細胞的共同染色。SYTOX藍色染料也是一種高親和力的核酸染料，只能滲透質(zhì)膜受損的細胞。它與核酸結(jié)合后的最大吸收峰約為445nm,能被汞弧燈的4

16、36nm譜線所激發(fā)。與許多藍色熒光染料不同，SYTOX藍色染料還能被鹵鎢燈有效激發(fā)。在定量膜受損的細菌細胞上，SYTOX藍色染料與綠色染料效果相當，同樣也不會干擾細菌細胞的生長。不過藍色和綠色的發(fā)射光譜有些重疊，因此SYTOX藍色染料還是與橙色或紅色探針一起使用，效果更佳。SYTOX橙色染料能清晰分辨死的細菌、酵母或哺乳動物細胞。它與PI相比，發(fā)射波長更短，它的光譜則更接近羅丹明的濾光片。此外，SYTOX橙色染料的消光系數(shù)比PI要高得多，在結(jié)合DNA時熒光顯著增強，表明它作為死細胞染料或核酸復染劑，有著更高的靈敏度。SYTOX橙色染料還是利用流式細胞儀進行DNA片段篩選時的最佳染料?；罴毎娜?/p>

17、色Hoechst熒光染料大家耳熟能詳?shù)腍oechst系列染料是一種雙苯甲亞胺(bisbenzimide)染料，主要有Hoechst33258和Hoechst33342等。它們是細胞膜通透性的小溝結(jié)合DNA染料，結(jié)合后發(fā)出明亮的熒光。Hoechst33342的膜通透性比Hoechst33258略好，相當易溶于水，細胞毒性小。它們可被大多數(shù)常用的熒光光源所激發(fā)，表現(xiàn)出相對較大的斯托克斯位移(激發(fā)/發(fā)射波長約為350/460nm),因此適合于多色標記實驗。在未結(jié)合DNA時，它們有著復雜的pH依賴光譜，在pH5時的熒光產(chǎn)量比pH8時要高得多。SDS等表面活性劑還能使熒光增強。Hoechst染料普遍用于多個細胞分析，包括細胞周期和凋亡研究，而且它們還是常用的核酸復染劑。此外，Hoechst33258還有一個特殊的應(yīng)用。由于它對瘧原蟲有毒性，因此可用于血液樣本的流式篩選，并評估患者的藥物敏感性。SYTO核酸染料Invitrogen的SYTO是活體核酸透性染料。這種染料對核酸的親和力較低，可通過被動運輸擴散透過大多數(shù)細胞的細胞膜。對活細胞和死細胞的DNA和RNA都可以進行染色。同時，也可用于革蘭氏陽性和陰性細菌的染色。染料通過紫外光或可見光激發(fā)而發(fā)出熒光。目前有藍、綠、橙和紅等幾種顏色。各種SYTO染料間的特性都不相同，包括細胞