MAPK、PI3K途徑在蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化的作用

1、MAPK、PI3K途徑在蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)PC12細(xì)胞分化的作用【關(guān)鍵詞】神經(jīng)生長(zhǎng)因子;,P12細(xì)胞;,細(xì)胞分化;,信號(hào)傳導(dǎo)摘要:目的研究絲裂原激活蛋白激酶(APK)和磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)/Akt途徑在蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)誘導(dǎo)P12細(xì)胞分化中的作用。方法應(yīng)用蛋白免疫印跡法分析p44/p42APK和Akt的磷酸化程度,并利用APK抑制劑PD98059和PI3K抑制劑LY294002,觀(guān)察其對(duì)NGF誘導(dǎo)的P12細(xì)胞形態(tài)學(xué)改變的影響。結(jié)果眼鏡蛇毒NGF在10ng/L即可誘導(dǎo)P12細(xì)胞長(zhǎng)出突起,100,1000ng/L作用明顯,呈劑量效應(yīng)關(guān)系;NGF能有效刺激p44/p42APK、Ak

2、t的磷酸化;分別用特異抑制劑PD98059抑制APK活性,LY294002抑制PI3K活性后,NGF誘導(dǎo)的細(xì)胞分化均受抑制。結(jié)論蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)P12細(xì)胞的分化作用與p44/p42APK和PI3K/Akt途徑相關(guān)。關(guān)鍵詞:神經(jīng)生長(zhǎng)因子;P12細(xì)胞;細(xì)胞分化;信號(hào)傳導(dǎo)ABSTRAT:bjetiveTinvestigatetherlefitgenativatedprtEinkinase(APK)andphsphinsitide3kinase(PI3K)/AktpathaysindifferentiatinfP12ellsinduedbynervegrthfatr(NGF)frven.ethds

3、Thephsphrylatinfp44/p42APKandAkteredetetedbyesternblt.TherlefAPKandPI3KintheellularatinfPV12ellsinduedbyNGFereassessedbyuseAPKandPI3KspeifiinhibitrPD98059andLY294002respetively.ResultsNGFfrbravenanstiulatep44/p42APKandAktphsphrylatinandinduethedifferentiatinfP12ellsfr10ng/Lt1000ng/L.Thedifferentiati

4、nfP12ellsinduedbyNGFasinhibitedhenAPKrPI3KpathayasablishedbythespeifiinhibitrPD98059andLY294002.nlusinThedifferentiatinfP12ellsbyNGFfrbravenrelatestp44/p42APKandPI3K/Aktpathay.KEYRDS:nervegrthfatr;P12ell;elldifferentiatin;signaltransdutin神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)自發(fā)現(xiàn)以來(lái),其在神經(jīng)系統(tǒng)中的作用倍受關(guān)注。實(shí)驗(yàn)說(shuō)明,NGF能促進(jìn)大鼠嗜鉻瘤P12細(xì)胞系的分化。NGF的

5、分化信號(hào)是通過(guò)與其高親和力受體TrkA結(jié)合而觸發(fā)的1,進(jìn)而依次激活一系列信號(hào)途徑。然而,信號(hào)途徑如何參與其激活增殖及分化調(diào)控還未完全清楚。多種細(xì)胞的生存、分化、凋亡信號(hào)通過(guò)受體RasRaf絲裂原激活蛋白激酶(APK)又稱(chēng)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)蛋白激酶(ERK)和受體磷脂酰肌醇3激酶(PI3K)Akt(又稱(chēng)蛋白激酶B)信號(hào)途徑進(jìn)展傳導(dǎo)23。筆者討論APK、PI3K信號(hào)途徑與眼鏡蛇毒來(lái)源的神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)的P12細(xì)胞分化間的關(guān)系。1材料和方法1.1材料1.1.1細(xì)胞株P(guān)12細(xì)胞(大鼠嗜鉻瘤細(xì)胞株),由福建醫(yī)科大學(xué)分子醫(yī)學(xué)研究中心鄭志教授贈(zèng)送。1.1.2主要試劑蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子(NGF)用凝膠通透層析和離子交

6、換層析等方法自蛇毒粗毒凍干粉(廣東產(chǎn)眼鏡蛇)中提純。信號(hào)途徑的特異抑制劑APK抑制劑PD98059、PI3K抑制劑LY294002(美國(guó)Prega公司),溶于DS配制成儲(chǔ)存液。抗pERK、pAkt(ser)、tubulin抗體,辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔、羊抗小鼠二抗,EL檢測(cè)系統(tǒng)(美國(guó)Santaruz公司)。多聚賴(lài)氨酸(PlyLLysine,美國(guó)Siga公司);DE/F12培養(yǎng)基(美國(guó)Gib公司);胎牛血清(杭州四季青生物工程材料);馬血清(美國(guó)Hylne公司)。1.2方法1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)P12細(xì)胞生長(zhǎng)于含10馬血清、5胎牛血清的DE/F12培養(yǎng)液(37,體積分?jǐn)?shù)為0.05的2,飽和濕度)

7、,常規(guī)傳代。實(shí)驗(yàn)時(shí)培養(yǎng)器皿用多聚賴(lài)氨酸溶液包被,增加P12細(xì)胞對(duì)培養(yǎng)器皿黏附力。1.2.2p44/p42APK、Akt磷酸化檢測(cè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期P12細(xì)胞接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板,用無(wú)血清培養(yǎng)液饑餓12h,參加不同濃度的PD98059(0.1,1,5,20,50和100l/L)或LY294002(1,25,50和100l/L)作用30in,再以100ng/LNGF作用10in。各組處理P12細(xì)胞用冷PBS洗2次,參加細(xì)胞裂解液(含1l/LNa3V4)0.15L,置冰上30in后,搜集,離心,上清液即為總的細(xì)胞蛋白溶解成分。按常規(guī)方法進(jìn)展蛋白免疫印跡,別離膠為10,100A轉(zhuǎn)膜(N膜),含5脫脂奶粉封閉液

8、封閉4過(guò)夜,依次結(jié)合一抗和二抗,最后用EL系統(tǒng)進(jìn)展檢測(cè),X光片顯影,以tubulin為內(nèi)參照。1.2.3抑制劑對(duì)NGF誘導(dǎo)的P12細(xì)胞分化的影響搜集常規(guī)培養(yǎng)的P12細(xì)胞于含2%胎牛血清的DE/F12培養(yǎng)液中。將細(xì)胞以5104L-1接種于經(jīng)多聚賴(lài)氨酸包被的24孔培養(yǎng)板中,每孔體積2L。細(xì)胞分組:對(duì)照組、NGF組(10,100,1000ng/L)、NGF100ng/L)+PD98059(20l/L)、NGF(100ng/L)+LY294002(50l/L),對(duì)照組參加等體積的培養(yǎng)液。每組3孔。倒置顯微鏡下觀(guān)察細(xì)胞分化的形態(tài)改變。細(xì)胞有1個(gè)或以上突起且突起的長(zhǎng)度為胞體直徑的2倍以上,確定為已分化細(xì)胞

9、4。作用4d,每組隨機(jī)選取10個(gè)視野(200),計(jì)數(shù),計(jì)算分化細(xì)胞的百分率。1.3統(tǒng)計(jì)學(xué)處理顯著性檢驗(yàn)采用t檢驗(yàn)。福建醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)2022年1月第41卷第1期何艷等：APK、PI3K途徑在蛇毒神經(jīng)生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)P12細(xì)胞分化的作用2結(jié)果2.1NGF刺激P12細(xì)胞p44/p42APK和Akt的磷酸化APK、PI3K等信號(hào)途徑可以被多種細(xì)胞生長(zhǎng)因子激活,參與介導(dǎo)細(xì)胞增殖、抗凋亡及分化等。P12細(xì)胞在無(wú)血清的培養(yǎng)液中饑餓12h,然后用100ng/LNGF刺激10in,esternblt結(jié)果顯示(圖1),NGF能明顯激活P12細(xì)胞p44/p42APK的磷酸化而活化,對(duì)Akt磷酸化也有激活作用。2.2抑制

10、劑對(duì)不同信號(hào)途徑的抑制作用為明確APK、PI3K途徑在P12細(xì)胞分化中的作用,應(yīng)用信號(hào)途徑的特異抑制劑,觀(guān)察這些抑制劑是否可以選擇性阻斷其特異的信號(hào)途徑。結(jié)果說(shuō)明PD98059劑量依賴(lài)性地抑制NGF刺激的p44/p42APK磷酸化,而不抑制Akt的磷酸化;LY294002對(duì)Akt的磷酸化抑制也呈劑量依賴(lài)性,而不抑制p44/p42APK的磷酸化(圖1)。2.3抑制劑對(duì)NGF誘導(dǎo)P12細(xì)胞分化的影響未經(jīng)NGF處理的P12細(xì)胞呈圓形或橢圓形,無(wú)明顯突起,參加10,100,1000ng/LNGF作用96h,可見(jiàn)細(xì)胞出現(xiàn)多個(gè)突起,有長(zhǎng)有短,突起數(shù)目不等,細(xì)胞出現(xiàn)明顯分化。而在NGF作用前30in,以20

11、l/LPD98059或50l/LLY294002預(yù)處理P12細(xì)胞,96h后P12細(xì)胞仍以圓形或橢圓形居多,突起細(xì)胞數(shù)明顯減少,細(xì)胞突起的長(zhǎng)度和數(shù)目也顯著降低,NGF誘導(dǎo)的P12細(xì)胞分化作用根本受到抑制(表1,圖2)。表1PD98059、LY294002對(duì)神經(jīng)生長(zhǎng)因子作用的P12細(xì)胞分化的影響略3討論NGF誘導(dǎo)P12細(xì)胞分化是研究細(xì)胞分化過(guò)程在分子、生化和生理程度上互相聯(lián)絡(luò)的一個(gè)很好的模型。雖然作用機(jī)制不非常清楚,但NGF誘導(dǎo)P12細(xì)胞蛋白質(zhì)磷酸化已有文獻(xiàn)報(bào)道56。APK是磷酸化瀑布中的激酶之一,是一族細(xì)胞質(zhì)內(nèi)廣泛分布的含有絲/蘇氨酸殘基的蛋白激酶,可被有絲分裂原和促分化因子激活。其激活對(duì)細(xì)胞的

12、生存、分化和凋亡起重要作用。PI3K是一種細(xì)胞內(nèi)磷脂酰肌醇激酶,由一個(gè)催化亞基(p110)和一個(gè)調(diào)節(jié)亞基(p85)構(gòu)成。PI3K是許多生命活動(dòng)中關(guān)鍵的信號(hào)分子,參與調(diào)節(jié)細(xì)胞的分裂、分化、凋亡等活動(dòng)。絲氨酸/蘇氨酸激酶Akt是PI3K下游直接的靶蛋白,是原癌基因akt的表達(dá)產(chǎn)物。多種細(xì)胞因子都能通過(guò)與其受體結(jié)合產(chǎn)生與PI3K的p85亞基高親和性的位點(diǎn),誘導(dǎo)Akt的活化。在P12細(xì)胞中,眼鏡蛇毒NGF對(duì)細(xì)胞的分化作用是否通過(guò)APK和PI3K途徑？國(guó)內(nèi)學(xué)者報(bào)道了長(zhǎng)白白眉蝮蛇(A.halys)蛇毒來(lái)源的NGF能激活P12細(xì)胞的APK激酶和APK并使其表達(dá)增加7。本研究發(fā)現(xiàn)眼鏡蛇毒來(lái)源的NGF能激活ER

13、K、PI3K/Akt信號(hào)途徑。p44/p42APK在NGF刺激5in后即可發(fā)生磷酸化而活化,10in明顯磷酸化。Akt作為PI3K的下游靶蛋白也在NGF作用后發(fā)生磷酸化而活化。為明確這些途徑的活化與蛇毒NGF誘導(dǎo)的P12細(xì)胞分化的關(guān)系,實(shí)驗(yàn)利用特異的抑制劑PD98059和LY294002分別阻斷APK和PI3K/Akt信號(hào)途徑,結(jié)果說(shuō)明,兩種抑制劑都能抑制激酶的活性,而且沒(méi)有穿插抑制作用。當(dāng)分別阻斷信號(hào)通路后,細(xì)胞的分化都受到明顯的抑制,即APK和PI3K/Akt途徑都參與NGF誘導(dǎo)的P12細(xì)胞的分化,與文獻(xiàn)報(bào)道一致5,8。與神經(jīng)前體細(xì)胞分化不完全一樣,BarnabeHEider等研究認(rèn)為,E

14、RK同時(shí)參與神經(jīng)前體細(xì)胞的分化和存活,而PI3K主要參與細(xì)胞的存活9。信號(hào)途徑的傳導(dǎo)與細(xì)胞分化之間存在復(fù)雜的關(guān)系。有研究認(rèn)為APK進(jìn)入核內(nèi)是P12細(xì)胞分化的關(guān)鍵,APK磷酸酶3(KP3)的存在可阻斷APK進(jìn)入核內(nèi)而抑制細(xì)胞分化10。也有研究認(rèn)為NGF激活Ras/APK信號(hào)是通過(guò)依賴(lài)AP反響元件結(jié)合蛋白(REB)的機(jī)制。而對(duì)PI3K信號(hào)途徑,NGF可能并不充分改變PI3K全部活性,更可能是使磷酸化而活化的PI3K分子在細(xì)胞內(nèi)重新定位,通過(guò)Gabl調(diào)節(jié)PI3K的活性,加強(qiáng)NGF誘導(dǎo)P12細(xì)胞DNA合成、存活和分化。因此,NGF誘導(dǎo)P12細(xì)胞的分化是一個(gè)包括APK和PI3K/Akt途徑在內(nèi)的復(fù)雜的信

15、號(hào)調(diào)節(jié)過(guò)程,有待更深一步的研究。參考文獻(xiàn)：1ZhangY,hebanDB,nayBR,etal.ellsurfaeTrkreeptrsediateNGFinduedsurvivalhileinternalizedreeptrsregulateNGFindueddifferentiatinJ.JNeursi,2000,20(15):56715678.2LiF,riN,JinG,etal.perativeexpressinfsurvivalpERKandpAktsignalsinratbrainneurnsaftertransientAJ.BrainRes,2022,962(1):2126.3al

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